全反式維甲酸抑制兔頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增殖和聚集素表達(dá)的研究

李彥飛 王愛民 鄭舒 董果雄

全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，atRA)是維生素A的 天然衍生物，它可通過調(diào)節(jié)多種生物活性因子的表達(dá)、阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程從而抑制血管平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell，SMC)的遷移、增殖，并促進(jìn)凋亡，發(fā)揮抗血管內(nèi)膜增殖作用［1，2］。聚集素是一個(gè)多功能蛋白質(zhì)，它具有促進(jìn)細(xì)胞聚集的作用，能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖，對(duì)內(nèi)皮損傷后血管內(nèi)膜增殖也有不利影響［3］，本實(shí)驗(yàn)旨在觀察血管內(nèi)皮損傷后聚集素的表達(dá)情況和atRA對(duì)聚集素表達(dá)的影響，探討atRA對(duì)血管再狹窄的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康新西蘭雄性大白兔36只，4個(gè)月齡，體重(2.5±0.12)kg，購自青島市動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。atRA(重慶華邦制藥公司)，膽固醇(上海化學(xué)制劑公司)，兔抗兔聚集素，SABC試劑盒(武漢博士德公司)，鼠抗兔增殖細(xì)胞核抗原［(proliferating cell nuclear antigen，PCNA(北京中杉)］，ElivisionTM plus試劑盒(福州邁新)，Masson三色試劑盒(福州邁新)，奧林巴斯BX50顯微鏡，Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型制作:36只新西蘭大白兔按體重隨機(jī)分為6 組:治療組(A、B)、對(duì)照組(A、B)、假手術(shù)組(A、B)，每組6只。治療組和對(duì)照組每天進(jìn)食150 g高脂飼料，含6.0%豬油、1.5%膽固醇、92.5%基礎(chǔ)飼料;假手術(shù)組每天喂養(yǎng)150 g基礎(chǔ)飼料;均自由飲水。喂養(yǎng)2周后行頸動(dòng)脈內(nèi)膜空氣干燥術(shù)，假手術(shù)組手術(shù)但不損傷內(nèi)膜。治療組術(shù)前3 d開始給予atRA 6mg·kg－1·d－1，溶于 1ml植物油中灌胃至處死，對(duì)照組、假手術(shù)組給予等量植物油灌胃。

內(nèi)膜空氣干燥術(shù):經(jīng)耳緣靜脈注射0.25 kg/L的烏拉坦1.0 g/kg，麻醉良好后頸部脫毛消毒，取頸正中縱形切口，分離右頸總動(dòng)脈2.0cm，選擇無分支段，動(dòng)脈夾夾閉兩端，4.5 G針頭平行穿刺阻斷血管的兩端，0.9%氯化鈉溶液沖洗血管腔，向夾閉段的頸總動(dòng)脈內(nèi)以120ml/min速度注入空氣10min，管腔內(nèi)重新注入0.9%氯化鈉溶液，放開動(dòng)脈夾，壓迫穿刺處約10min止血，觀察血流通暢后逐層縫合。術(shù)后給予青霉素40萬 U，肌內(nèi)注射，1次/d，連續(xù)3 d。

分別于術(shù)后第7天、28天處死A、B組動(dòng)物，取病變部位血管等距切分4～5段，10%中性緩沖甲醛固定，石蠟包埋。血管標(biāo)本橫截面連續(xù)切片，厚度4 μm，間隔100 μm再次切片，共切3個(gè)層面。

1.2.2 形態(tài)學(xué)測(cè)定:切片行HE染色及Masson染色，顯微鏡下觀察血管結(jié)構(gòu)，用Image-Pro Plus進(jìn)行圖像分析，每例動(dòng)物觀察3張切片，測(cè)定每張切片上各個(gè)血管截面的內(nèi)膜面積、中膜面積、內(nèi)膜/中膜面積比、管腔狹窄度，管腔狹窄度=內(nèi)膜面積/內(nèi)彈力板下面積×100%，取平均值。

1.2.3 免疫組化檢測(cè)聚集素、PCNA表達(dá):用SABC三步法進(jìn)行聚集素免疫組化染色，3%過氧化氫滅酶，微波修復(fù)，一抗稀釋度1∶200，4℃過夜，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，胞核及胞漿棕黃、棕褐色為陽性。PBS代替一抗作陰性對(duì)照。用IPP進(jìn)行圖像分析，隨機(jī)測(cè)量每張切片中6個(gè)高倍視野的陽性部位平均光密度和陽性面積百分比，取其平均值，二者乘積乘以100為陽性表達(dá)指數(shù)。

二步法進(jìn)行PCNA染色，微波修復(fù)，3%過氧化氫滅酶，一抗稀釋度1∶100，室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，胞核棕黃、棕褐色為陽性。PBS代替一抗作陰性對(duì)照。計(jì)數(shù)陽性胞核占總胞核比例，乘以陽性胞核平均光密度，二者乘積乘以100為PCNA陽性表達(dá)指數(shù)，其他分析過程同聚集素。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)或方差分析，組間比較采用S-N-K法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無死亡或患病，未發(fā)現(xiàn)手術(shù)部位感染，切口愈合良好。

2.1 血管組織形態(tài)情況 假手術(shù)組兔頸動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞完整，內(nèi)膜無增厚，7 d和28 d血管結(jié)構(gòu)無明顯差別。對(duì)照組術(shù)后7 d時(shí)血管內(nèi)皮再生，尚未完全覆蓋管腔，內(nèi)彈力板多處斷裂，有SMC遷移入內(nèi)膜，內(nèi)膜開始增厚，可見泡沫細(xì)胞。28 d時(shí)血管腔表面凹凸不平，鏡下見動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚，管腔狹窄，內(nèi)膜層有大量SMC增生，排列紊亂，胞核形態(tài)不一。還可見到典型動(dòng)脈粥樣硬化偏心性狹窄，內(nèi)膜有泡沫細(xì)胞聚集，中膜亦有SMC向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)變。治療組病變與對(duì)照組相似，但術(shù)后28 d時(shí)內(nèi)膜增厚程度明顯輕于對(duì)照組，泡沫細(xì)胞較少。術(shù)后7 d時(shí)治療組的內(nèi)膜面積、內(nèi)膜/中膜面積比、管腔狹窄度與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.004～1.502，P ＞0.05)，術(shù)后28 d時(shí)治療組的內(nèi)膜面積、內(nèi)膜/中膜面積比、管腔狹窄度均低于對(duì)照組(t=4.770，t=5.092，t=3.802，P ＜0.01)，術(shù)后7 d各組間、28 d各組間中膜面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.723、F=1.234，P ＞0.05)。見表 1。

表16 組血管形態(tài)學(xué)比較 n=6，

表16 組血管形態(tài)學(xué)比較 n=6，

注:與對(duì)照B組比較，*P ＜0.01

組別 內(nèi)膜面積(A/mm2)中膜面積(A/mm2)內(nèi)膜/中膜面積比管腔狹窄度(%)假手術(shù)A組 — 0.33±0.05— —假手術(shù)B組 — 0.33±0.06 — —對(duì)照 A 組 0.14 ±0.07 0.38 ±0.07 0.36 ±0.12 20 ±9對(duì)照 B 組 0.37 ±0.10 0.39 ±0.07 0.94 ±0.19 48 ±10治療 A 組 0.11 ±0.05 0.37 ±0.06 0.29 ±0.11 14 ±6治療 B 組 0.15 ±0.04* 0.36 ±0.07 0.44 ±0.14* 22 ±10*

2.2 atRA對(duì)聚集素、PCNA表達(dá)的影響 假手術(shù)組術(shù)后7 d、28 d未見聚集素表達(dá)。對(duì)照組術(shù)后7 d時(shí)，聚集素在新生內(nèi)皮層和中膜SMC表達(dá)，術(shù)后28 d時(shí)(圖1)表達(dá)增強(qiáng)，血管各層均有表達(dá)，細(xì)胞間質(zhì)也有表達(dá)，在新生內(nèi)膜深面及中膜靠近內(nèi)彈力板處、粥樣硬化斑塊部位明顯，可見泡沫細(xì)胞表達(dá)。治療組聚集素表達(dá)部位規(guī)律與對(duì)照組相同，但術(shù)后7 d、28 d時(shí)(圖1)陽性表達(dá)指數(shù)低于對(duì)照組。見表2。

圖1 空氣干燥術(shù)后28 d聚集素表達(dá)(免疫組化×200)

2.3 假手術(shù)組偶見微量PCNA表達(dá) 對(duì)照組術(shù)后7 d時(shí)，PCNA在新生內(nèi)膜和中膜強(qiáng)表達(dá)，陽性胞核體積較大，有異型性，術(shù)后28 d時(shí)陽性表達(dá)指數(shù)下降，內(nèi)皮細(xì)胞、SMC及泡沫細(xì)胞表達(dá)。治療組表達(dá)部位規(guī)律與對(duì)照組一致，但7 d、28 d時(shí)表達(dá)均明顯低于對(duì)照組(P ＜0.05或 ＜0.01)。見表2。

表2 atRA對(duì)聚集素、PCNA陽性表達(dá)的影響 n=6，

表2 atRA對(duì)聚集素、PCNA陽性表達(dá)的影響 n=6，

注:與對(duì)照 A 組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01;與對(duì)照 B 組比較，△P ＜0.01

PCNA對(duì)照A組組別 聚集素5.5 ±1.4 31.9 ±7.5對(duì)照 B 組 9.6 ±1.8 19.4 ±4.9治療 A 組 3.5 ±1.0* 13.3 ±4.3#治療B 組 6.4±1.6△ 8.3±2.6△

3 討論

在本實(shí)驗(yàn)中我們應(yīng)用PCNA來檢測(cè)細(xì)胞的增殖狀況，PCNA是DNA多聚酶δ的輔助蛋白，在DNA合成時(shí)促進(jìn)DNA的延長(zhǎng)，在G1期晚期和S期表達(dá)，是細(xì)胞進(jìn)入并通過S期所必需的，可作為反映細(xì)胞增殖程度的可靠指標(biāo)。

在高脂飲食和內(nèi)皮損傷后，PCNA表達(dá)明顯增加，在28 d時(shí)有所下降仍顯著高于正常動(dòng)脈，細(xì)胞呈現(xiàn)出一種過度增殖狀態(tài)。應(yīng)用atRA后明顯減輕了血管PCNA的表達(dá)，表明atRA對(duì)血管壁的多種細(xì)胞、尤其SMC的增殖起到了抑制作用，進(jìn)而下調(diào)了這種高增殖狀態(tài)。

聚集素是一個(gè)分泌型的糖蛋白，它作用廣泛，在體外具有促進(jìn)細(xì)胞聚集的作用，和多種疾病如糖尿病、動(dòng)脈硬化、腫瘤、腎臟及神經(jīng)系統(tǒng)疾病有密切關(guān)系。Kim等［4］觀察到聚集素通過抑制TNF-a刺激MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、MMP-9等的表達(dá)，抑制血管SMC的遷移，并能抑制血管SMC的DNA合成，腺病毒轉(zhuǎn)染聚集素可以抑制球囊損傷大鼠頸動(dòng)脈的新生內(nèi)膜增厚，認(rèn)為在血管損傷后聚集素的上調(diào)可能起到了保護(hù)性作用。但更多證據(jù)表明聚集素具有促進(jìn)SMC的增殖和遷移的作用，并能抑制細(xì)胞凋亡［3，5］。抑制聚集素表達(dá)可以減輕血管SMC的增殖，聚集素基因敲除還可以減輕大鼠的動(dòng)脈粥樣硬化病變［6，7］。

我們觀察到在血管內(nèi)皮損傷后聚集素開始表達(dá)，自術(shù)后7～28 d呈升高趨勢(shì)，強(qiáng)表達(dá)于新生內(nèi)膜、中膜，細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)均有出現(xiàn)。在增生較重內(nèi)膜、粥樣硬化斑塊部位最明顯，與PCNA表達(dá)一致，表明它的過度表達(dá)刺激了血管內(nèi)膜、中膜細(xì)胞的大量增殖，推測(cè)細(xì)胞間質(zhì)的聚集素對(duì)細(xì)胞的遷移、叢聚也起到了促進(jìn)作用，最終導(dǎo)致了血管內(nèi)膜增殖、血管重塑。應(yīng)用atRA后明顯下調(diào)了聚集素的表達(dá)，與對(duì)照組比較差異顯著。通過抑制聚集素的促血管SMC遷移、增殖等作用，atRA改善了內(nèi)皮損傷后的血管重塑。這與Orlandi等［5］的結(jié)果一致。研究表明聚集素和動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)，血清聚集素水平可以作為冠心病的標(biāo)記物之一［8］。其可行性有待進(jìn)一步證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高脂飲食及內(nèi)皮損傷后，血管組織聚集素持續(xù)、過多地表達(dá)，刺激了SMC等細(xì)胞遷移、增殖，最終導(dǎo)致了血管再狹窄病變形成。應(yīng)用atRA能明顯減輕內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增殖和血管再狹窄，抑制聚集素表達(dá)分泌是其機(jī)制之一。

1 褚現(xiàn)明，李冰，杜日映，等.P27對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈球囊損傷后管腔狹窄的作用.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2006，14:417-421.

2 李彥飛，董果雄，張社華.全反式維甲酸對(duì)兔頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增殖和VEGF及VCAM-1表達(dá)的影響.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，45:101-103.

3 Miyata M，Biro S，Kaieda H，et al.Apolipoprotein J/clusterin is induced in vascular smooth muscle cells after vascular injury.Circulation，2001，104:1407-1412.

4 Kim HJ，Yoo EK，Kim JY，et al.Protective role of clusterin/apolipoprotein J against neointimal hyperplasia via antiproliferative effect on vascular smooth muscle cells and cytoprotective effect on endothelial cells.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29:1558-1564.

5 Orlandi A，Pucci S，Ciucci A，et al.Modulation of clusterin isoforms is associated with all-trans retinoic acid-induced proliferative arrest and apoptosis of intimal smooth muscle cells.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25:348-353.

6 Shirasawa T，Miyata M，Eto H，et al.Deficiency of clusterin inhibits neointimal hyperplasia after vascular injury.J Atheroscler Thromb，2009，16:772-781.

7 Hamada N，Miyata M，Eto H，et al.Loss of clusterin limits atherosclerosis in apolipoprotein e-deficient mice via reduced expression of Egr-1 and TNF-α.J Atheroscler Thromb，2011，18:209-216.

8 Poulakou MV，Paraskevas KI，Wilson MR，et al.Apolipoprotein J and leptin levels in patients with coronary heart disease.In Vivo，2008，22:537-542.