骨關節炎患者關節液中亞硫酸鹽及P物質含量變化

柳慶坤 秦杏坤 平會 劉曉松 李亞貞 趙建偉

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種慢性退化性關節疾病，50歲以上者多發，膝關節疼痛是最常見、最突出的癥狀，常使患者行走困難，活動受限，甚至致殘，嚴重影響日常生活［1］。臨床上對OA患者的治療，主要是緩減關節疼痛、改善關節功能，缺乏有效的方法控制和治療OA。隨著對OA的深入研究，人們逐漸認識到骨關節炎是由多種因素相互作用形成的，OA的生物學行為涉及到分子生物學、細胞生物學和機械力學等許多方面，目前普遍認為細胞因子在OA軟骨的破壞上起關鍵作用，而關節疼痛主要與局部P物質的作用有關［2］。有關亞硫酸鹽在炎癥反應中的作用已有報道，它是一種中性粒細胞抗微生物因子和參與炎癥反應的炎性介質［3］。而有關亞硫酸鹽在骨關節炎發病過程中的作用尤其是與關節疼痛的關系尚未見報道，因此，我們擬通過收集中重度膝關節炎患者的關節液，測定其SO2及P物質的含量變化，初步探討亞硫酸鹽對骨關節炎發病的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2008年8月至2010年8月我院骨科住院患者36例，男12例，女24例;年齡50～75歲，中位年齡63歲;病史1.5～26.3 年，平均10.5 年。納入標準［4］:(1)符合骨關節炎的診斷依據，分級標準為中重度;(2)至少6個月病史;(3)雙側膝關節炎者，以癥狀嚴重側入選;(4)無心血管、肝、腎等重要臟器病變;(5)排除活動性胃腸病變者及曾發生過消化性潰瘍或胃十二指腸出血病史;(6)排除類風濕關節炎、感染性關節炎等其他關節疾患。所有病例均為我科初診患者，就診時近6個月未使用其他止痛藥物、皮質類固醇藥物及具有消炎鎮痛作用的中藥制劑。

1.2 臨床分組及標本留取 所有患者均在無菌操作下抽取患側膝關節液，然后注射玻璃酸鈉注射液2ml(山東福瑞達醫藥集團)，1次/周，連續5周。第8周末隨訪患者并在無菌操作下抽取患側膝關節滑液。每次所取關節液至少2ml，所得標本3000 r/min，離心 10min，取上清液 200 μl，－70℃凍存。血清來自臨床常規生化檢測后剩余標本。根據患者病程共分為3組，每組36例:(1)急性期組:患者確診膝關節炎，分級為中重度，需行關節腔減壓治療;(2)恢復期組:經5個療程的關節腔內注射玻璃酸鈉，第8周復查患者;(3)隨訪期組:經治療后癥狀明顯好轉半年以上。3組一般資料比較差異無統計學意義(P ＞0.05)，具有可比性。

1.3 實驗方法

1.3.1 亞硫酸鹽含量測定:取關節液 100 μl，加入 70 μl硼氫化鈉，室溫孵育 30min，加入 5 μl mBrB，充分混勻，42℃孵育10min，然后加 40 μl高氯酸混勻，12400 × g，室溫離心 10min，取上清，加 10 μl Tris液(2.0 mol/L，pH 值 3.0)輕輕混勻，12400 ×g，室溫離心10min，留取上清液4℃避光保存。取標本 5 μl進樣分析，流動相 A:甲醇:乙酸:水(5∶0.25∶94.75，體積比，pH值3.4)，流動相B:甲醇。甲醇洗脫梯度:0～5min 5%;5～10min 35%;10～17min 45%;17.01～22min 100%;22.01～27min 5%。流速:1.0ml/min。激發波長392 nm，檢測波長479 nm。

標準曲線的測定:以Na2SO3作為標準品，稀釋為如下濃度:0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、4、6 μmol/L，按上述步驟處理后進行檢測，繪制標準曲線。見圖1。

圖1 亞硫酸鹽標準曲線

1.3.2 P物質、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)和白介素-8(IL-8)的檢測:采用ELISA法檢測，試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司，嚴格按說明操作，根據標準曲線求出樣品中P物質、IL-1、IL-6和IL-8的含量。

1.4 統計學分析應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膝骨關節炎患者關節液中各因子含量變化 膝關節液中亞硫酸鹽含量在恢復期較急性期顯著降低，差異有統計學意義(t=12.975，P ＜0.01);而隨訪期關節液中亞硫酸鹽含量較恢復期雖然有所降低，但差異無統計學意義(t=1.683，P＞0.05)。P物質、IL-1、IL-6和IL-8在膝關節液中的含量變化與亞硫酸鹽基本一致，恢復期較急性期顯著降低(t值分別為16.901、14.960、12.089 和 13.264，P ＜0.01);但是，隨訪期 P物質和IL-1較恢復期進一步降低，差異有統計學意義(t值分別為6.659和 7.221，P ＜0.01);而 IL-6和 IL-8雖然也有降低，但差異無統計學意義(t值分別為2.354和1.352，P ＞0.05)。

表1 膝骨關節炎患者關節液中各因子含量變化

表1 膝骨關節炎患者關節液中各因子含量變化

注:與恢復期比較，*P ＜0.05

項目 急性期 恢復期 隨訪期亞硫酸鹽 (μmol/L)9.2 ±3.3 4.4 ±2.2 3.6 ±2.2 P物質(ng/L) 92±24* 72±19 60±16*IL-1(ng/L) 43±10* 23±9 10±6*IL-6(ng/L) 168±34* 120±19 106±21 IL-8(ng/L) 241±27*125±12 118±24

2.2 患者膝關節液中亞硫酸鹽和P物質的相關性分析 OA患者的膝關節液中亞硫酸鹽和P物質，具有相關性(r=0.804，P ＜0.05)。見圖2。

圖2 膝關節液中亞硫酸鹽與P物質水平相關性分析

3 討論

OA是一個復雜的多因子的關節退行性病變，其發病過程有多種機制參與。其中炎癥是主要的發病機制，通過改變細胞因子體系參與OA的發病過程［4－7］。而OA患者的關節疼痛除與軟骨下骨暴露和骨內壓增高有關外，主要與P物質有關［8］。關節滑膜阻止中的P物質是一種強致痛物質，可直接激活滑膜組織的痛覺感受器(C類纖維)，而且刺激巨噬細胞、中性粒細胞、內皮細胞，誘導這些細胞的吞噬作用、作用和血管的滲出。單核細胞受到P物質的刺激釋放IL-1和腫瘤壞死因子以及其他細胞因子，這些炎性介質又可激活成纖維細胞和軟骨細胞釋放膠原酶和蛋白酶，后者進入關節液中刺激骨膜和末梢神經產生疼痛。國內已有學者通過測定輕、中、重度膝關節OA患者膝關節液中P物質與白介素1β的含量。發現OA組膝關節液中P物質和白介素1β濃度顯著高于對照組;滑液中白介素1β濃度與OA嚴重程度呈正相關，滑液中P物質與OA嚴重程度呈正相關，滑液中白介素1β與P物質濃度呈正相關。認為P物質和白介素1β與膝OA的發病和病情發展密切相關;且兩者在OA的發病及病情發展中可能發揮相互協同作用［2］。

近年來，有關氣體信號分子在OA發病過程中的作用已有報道，Cillero-Pastor等［9］研究發現一氧化氮(nitric oxide，NO)可通過調節線粒體功能降低OA患者滑膜細胞的活性。Whiteman等［10］通過檢測類風濕性關節炎、OA和健康志愿者的關節滑液中的硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)，發現三者血漿H2S無明顯差異，而類風濕性關節炎關節滑液中的H2S含量顯著高于骨關節炎和健康志愿者。由此可以看出，氣體信號分子在關節炎的發病過程中發揮一定的病理生理學作用。

本研究結果發現，膝關節液中亞硫酸鹽含量在恢復期較急性期顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.05);而隨訪期關節液中亞硫酸鹽含量較恢復期雖有所降低，但差異無統計學意義(P＞0.05)。P物質、IL-1、IL-6和IL-8在膝關節液中的含量變化與亞硫酸鹽基本一致，恢復期較急性期顯著降低。值得注意的是，隨訪期P物質和IL-1較恢復期進一步降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，這與文獻報道一致［2］。骨關節炎患者的膝關節液中亞硫酸鹽和P物質二者具有相關性，相關系數為0.804(P＜0.05)。進一步提示P物質與亞硫酸鹽參與了骨性關節炎的發病，且與骨關節炎患者的疼痛具有一定的相關性。

總之，內源性亞硫酸鹽在骨性關節炎的發病過程中發揮著一定的抗感染防御反應，同時也與局部的P物質協同引起關節的疼痛。但是，有關內源性亞硫酸鹽參與骨性關節炎的炎癥反應機制尚需進一步深入研究。

1 Stevens-Lapsley JE，Kohrt WM.Osteoarthritis in women:effects of estrogen，obesity and physical activity.Womens Health(Lond Engl)，2010，6:601-615.

2 雷光華，高曙光，李康華，等.P物質與白細胞介素1β在膝骨關節炎發病中的作用及其相關性.中國組織工程研究與臨床康復，2008，12:7237-7240.

3 Mitsuhashi H，Nojima Y，Tanaka T，et al.Sulfite is released by human neutrophils in response to stimulation with lipopolysaccharide.J Leukoc Biol，1998，64:595-599.

4 Fransen M，Bridgett L，March L，et al.The epidemiology of osteoarthritis in Asia.Int J Rheum Dis，2011，14:113-121.

5 Driban JB，Balasubramanian E，Amin M，et al.The potential of multiple synovial-fluid protein-concentration analyses in the assessment of knee osteoarthritis.J Sport Rehabil，2010，19:411-421.

6 Stannus O，Jones G，Cicuttini F，et al.Circulating levels of IL-6 and TNF-α are associated with knee radiographic osteoarthritis and knee cartilage loss in older adults.Osteoarthritis Cartilage，2010，18:1441-1447.

7 Santosml，Gomes WF，Pereira DS，et al.Muscle strength，muscle balance，physical function and plasma interleukin-6(IL-6)levels in elderly women with knee osteoarthritis(OA).Arch Gerontol Geriatr，2011，52:322-326.

8 陳百成，王曉峰，張靜，等.膝關節骨關節炎滑膜中神經生長因子和P物質水平測試與觀察.中華骨科雜志，2003，23:156-160.

9 Cillero-Pastor B，Martin MA，Arenas J，et al.Effect of nitric oxide on mitochondrial activity of human synovial cells.BMC Musculoskelet Disord，2011，12:42.

10 Whiteman M，Haigh R，Tarr JM，et al.Detection of hydrogen sulfide in plasma and knee-joint synovial fluid from rheumatoid arthritis patients:relation to clinical and laboratory measures of inflammation.Ann N Y Acad Sci，2010，1203:146-150.