枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

黃璠 蔡俊

在我國，飼用酶制劑的開發(fā)與利用始于20世紀(jì)90年代[1]。多年來，人們發(fā)現(xiàn)蛋白酶對動物尤其是幼齡動物有著獨特的作用，目前飼料工業(yè)中應(yīng)用的蛋白酶多為酸性蛋白酶，而不同pH值的蛋白酶對飼料作用的影響正成為飼料行業(yè)的一個研究熱點，已有相關(guān)報道，中性蛋白酶作為飼料添加劑有很好的效果[2－4]。但中性蛋白酶的產(chǎn)量低、成本高等因素限制了其大規(guī)模應(yīng)用[5]。本研究以枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的發(fā)酵條件為研究對象，通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了產(chǎn)酶的發(fā)酵條件，取得了很好的效果，為進一步提高該菌產(chǎn)中性蛋白酶的能力奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/l、牛肉膏 5 g/l、氯化鈉5 g/l、瓊脂 20 g/l、水 1 L，pH 值 7.2～7.4。

種子培養(yǎng)基：液體斜面培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/l、牛肉膏5 g/l、蔗糖10 g/l、磷酸氫二鈉 4 g/l、硫酸鎂 0.2 g/l、水 1 L，pH 值 7.2。

1.2 試驗方法

1.2.1 初始發(fā)酵條件

取活化好的斜面菌株，接種一環(huán)到一級種子培養(yǎng)基（50/250 ml），37℃、160 r/min培養(yǎng)14 h后，以3%(V/V)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基（50/250 ml），37℃、160 r/min培養(yǎng)48 h。

1.2.2 蛋白酶活力測定[6]

按國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T23527—2009)，采用 Folin－酚法測定中性蛋白酶活力。

1.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.3.1 發(fā)酵條件的單因素試驗

采用單因素試驗，分別考察裝液量、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵周期、接種量和發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響。裝液量(250 ml三角瓶中)分別為 30、50、70、90 ml；轉(zhuǎn)速分別取160、180、200和220 r/min；培養(yǎng)基初始pH值分別取 6.2、6.7、7.2、7.7和 8.2；發(fā)酵周期分別取24、36、48、60、72 和 84 h；接種量分別取 1%、2%、3%、4%、5%；發(fā)酵溫度分別取33、35、37、39和 41 ℃。

1.2.3.2 發(fā)酵條件的正交試驗

在上述單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取部分影響較大的因素（裝液量、初始pH值、發(fā)酵周期），進一步縮小范圍進行3因素3水平正交試驗，正交試驗因子與水平設(shè)計見表1。……