芎芪合劑對大鼠腦缺血再灌注后自由基損傷相關指標的影響*

張新春 黃 燕

（廣東省中醫院，廣東 廣州 510120）

在腦缺血性損傷機制中，自由基連鎖反應被認為是造成腦組織損害的重要機制之一，缺血后再灌注可促發自由基的連鎖反應，加重缺血性損傷，造成嚴重的神經元壞死［1］。抑制自由基的產生及自由基清除對缺血再灌注損傷具有保護作用。本實驗應用益氣活血中藥（芎芪合劑）對腦缺血-再灌注損傷大鼠模型進行干預，從其對大鼠缺血腦組織中氧自由基損傷相關指標的影響來探討芎芪合劑的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級成年雄性SD大鼠30只，體質量250～300 g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.2 儀器與試劑 包括眼科剪、組織剪、玻璃分針、鋼尺、刀柄、刀片、眼科鑷（彎）、無齒鑷、持針器、小角針、手術線、無菌彎盤、紗布、棉球、漁線、酒精燈、手術臺、手術燈等。超氧化物岐化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒，均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 藥物 芎芪合劑，規格為 10 mL/支，呈棕黃色，澄清透明，由黃芪總皂苷 1.0 g、芍藥總苷 0.90 g、磷酸川芎嗪 0.10 g 溶于9 mL注射用水，以1%NaOH調節pH至8，定容至10 mL得濃縮藥液，相當于生藥：蒙古黃芪50 g，赤芍 30 g，川芎10 g，由廣東省中醫院制劑室提供。

1.4 模型制備 參照Koizumi［2］方法制成大鼠大腦中動脈缺血-再灌注模型。術后2 h觀察大鼠的癥狀和體征，參照Zealonga評定神經功能缺損程度的5級4分法標準［3］，0分為無神經功能缺損癥狀；1分為輕微神經功能缺損，不能完全伸展左側前爪；2分為中度局灶性神經功能缺損，向左側轉圈；3分為重度局灶性神經功能缺損，向左側傾倒；4分為不能自發行走，意識水平下降。評分在1～3分為造模成功，納入實驗。假手術組可出現同側Horner征，但無左側肢體癱瘓。

1.5 分組及給藥 將大鼠用隨機數字表法隨機分成假手術組，模型組，芎芪合劑組，每組10只。栓塞后1.5 h各組開始給藥：（1）假手術組、模型組腹腔注射生理鹽水 2 mL/200 g；（2）芎芪合劑組腹腔注射中藥稀釋液2 mL/200 g，為臨床用量10倍（以臨床用量200 mg/70 kg計）。栓塞后2 h拔出線栓形成再灌注。芎芪合劑組再灌注12 h后腹腔注射芎芪合劑稀釋液2 mL/200 g，假手術組、模型組再灌注12 h后腹腔注射生理鹽水2 mL/200 g。

1.6 標本采集與檢測 在缺血2 h再灌注24 h評分后，各組大鼠斷頭取腦，完整剝取腦組織，用冷生理鹽水將表面的血液沖洗干凈，去除嗅球、小腦和低位腦干，取右側（缺血側）腦組織用于制作勻漿液。腦組織置于玻璃勻漿器中，加入9倍量的冷生理鹽水，手工勻漿，充分研磨3～5 min，使組織勻漿化，將制備好的10%勻漿用離心機于4℃，3000 r/min離心15 min，取上清液于-75℃冰箱中保存待測。以上所有手工操作均在冰盤上進行。

1.6.1 SOD含量測定 將10%腦勻漿用生理鹽水稀釋成1%的組織勻漿，4 ℃，4000 r/min 離心 10 min，取上清30 μL，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD含量，按試劑盒說明操作。

1.6.2 MDA含量測定 用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定。將10%腦勻漿于 4℃，4000 r/min離心 10 min，取上清 100 μL，采用TBA比色法測定MDA含量，按試劑盒說明操作。

1.7 統計學處理 應用SPSS13.0統計軟件。數據以（±s）表示，數據進行單因素方差分析，然后用posthoc檢驗中的LSD法（方差齊時）或Dunnett’s T3（方差不齊時）作多個均數間的兩兩比較。檢驗水準α=0.05，雙側檢驗。

2 結 果

2.1 一般情況 假手術組大鼠精神狀態良好，毛色正常。模型組和芎芪合劑組術后出現精神萎頓，倦怠嗜唾，四肢蜷縮，活動性差，對外界敏感性下降，自發活動減少，毛色光澤暗淡，舌質明顯絳紫或暗淡等。提示大鼠在腦缺血再灌注后出現了類似于腦梗死“氣虛血瘀”的病理狀態［4］。

2.2 芎芪合劑對MCAO再灌注后大鼠腦組織中SOD含量的影響 見表1。模型組大鼠缺血側腦組織中SOD含量較假手術組降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；芎芪合劑組大鼠缺血側腦組織中SOD含量較模型組提高，差異有統計學意義（P＜0.05），提示芎芪合劑能提高大鼠缺血側腦組織中SOD含量，并使之趨向于正常。

表1 各組大鼠缺血2 h再灌注24 h SOD、MDA含量比較（±s）

表1 各組大鼠缺血2 h再灌注24 h SOD、MDA含量比較（±s）

與芎芪合劑組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

組 別 n SOD（U/mg） MDA（nmol/mg）假手術組 10 146.88±21.54▲ 3.41±1.29▲模型組 10 87.81±19.51△ 5.06±1.48△芎芪合劑組 10 137.50±42.51▲ 3.68±1.33▲

2.3 芎芪合劑對MCAO再灌注后大鼠腦組織中MDA含量的影響 見表1。模型組與假手術組比較差異有統計學意義 （P＜0.05），提示腦缺血2 h再灌注24 h后，模型組大鼠缺血側腦組織中MDA含量增高；芎芪合劑組與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05），提示芎芪合劑組大鼠缺血側腦組織中MDA含量較模型組減低；芎芪合劑組與假手術組比較差異無統計學意義 （P＞0.05），提示芎芪合劑能降低大鼠缺血側腦組織中MDA含量，并使之趨向于正常。

3 討 論

腦脈瘀阻是腦梗死發病過程中的關鍵病理機制，血運重建再灌注治療可在短時間內“袪除瘀阻”，迅速恢復腦部血液供應，但在治療后極易出現腦缺血-再灌注損傷的情況。依據黃燕教授的臨床經驗，腦梗死血運重建治療后腦缺血-再灌注損傷以氣虛、血瘀為主要病機，因此，益氣活血法是腦缺血-再灌注損傷主要治療法則。本研究所用藥物即是根據導師的經驗思路，采用益氣活血的治療原則，選取黃芪、赤芍、川芎的有效部位：黃芪總苷、赤芍總苷、川芎嗪組成芎芪合劑，以期能夠減輕大鼠腦缺血-再灌注損傷的程度。

人體正常代謝也產生自由基。但體內存在相應的自由基清除酶，如SOD等，產生與清除間動態平衡，不發生自由基連鎖反應和組織損傷［5］。但在腦缺血、外傷等病理條件下，清除酶活性降低，自由基產生增多，動態平衡嚴重破壞，則可啟動自由基連鎖反應，造成缺血損傷進一步加重。脂質過氧化代謝產物MDA的含量可以反映機體受自由基攻擊的程度。而SOD是體內主要自由基清除酶，能夠有效地清除并終止超氧陰離子引發的連鎖反應［6］。MDA顯著升高，說明腦組織缺血后氧自由基脂質過氧化反應增強；SOD下降可能是增強的脂質過氧化反應消耗了過多的抗氧化酶，氧化-抗氧化平衡被打破。因此，SOD和MDA含量的變化可間接反映自由基在體內的生成和體內抗氧化防御作用的功能狀況。

從本實驗結果表明，腦缺血2 h再灌注24 h后，模型組大鼠缺血側腦組織中SOD含量降低；芎芪合劑能提高大鼠缺血側腦組織中SOD含量，并使之趨向于正常。而腦缺血2 h再灌注24 h后，模型組大鼠缺血側腦組織中MDA含量增高；芎芪合劑能減低大鼠缺血側腦組織中MDA含量，并使之趨向于正常。以上結果提示，在腦缺血再灌注損傷的過程中，芎芪合劑能夠通過升高腦組織中SOD的含量，同時降低MDA的含量來達到抗氧自由基氧化損傷的作用，從而對缺血再灌注腦組織產生一定的保護作用。

［1］馮加純.細胞內鈣超載和自由基與遲發性神經元壞死［J］.中風與神經疾病雜志，1993，10（3）：188-189.

［2］Koizumi J，Yoshida Y，Nakazawa T，et al.Experimental studies of ischemic brain edema：A new experiment model of cerebralem bolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area［J］.Stroke，1986，8（1）：1-8.

［3］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without Craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84-91.

［4］郭建隊，楊秀清，陳梅.氣虛血瘀證腦梗死動物模型的制作［J］.現代中醫藥，2005，25（3）：1-3.

［5］Suzuki J.Chemiluminescence in hypoxic brain［J］.Stroke，1988，19：65.

［6］Kinute Y，Kikuchi H，Ishikawa M，et al.Lipid peroxidation in focal cerebral ischemial［J］.Neurosurg，1989，7（3）：420.