P16 INK4a蛋白及人乳頭瘤病毒檢測(cè)對(duì)宮頸癌前病變的預(yù)測(cè)價(jià)值

金 艷，曹樹軍，楊道華，施華珍，錢金風(fēng)

P16 INK4a蛋白及人乳頭瘤病毒檢測(cè)對(duì)宮頸癌前病變的預(yù)測(cè)價(jià)值

金 艷，曹樹軍，楊道華，施華珍，錢金風(fēng)

目的 探討P16 INK4a蛋白及人乳頭瘤病毒 (HPV)DNA對(duì)檢測(cè)宮頸癌前病變的預(yù)測(cè)價(jià)值。方法 收集2008年11月—2011年10月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一人民醫(yī)院松江分院經(jīng)細(xì)胞學(xué)篩查、陰道鏡活檢、組織病理學(xué)診斷為宮頸上皮內(nèi)瘤變 (CIN)，并根據(jù)病變程度和患者意愿行宮頸錐切治療的705例患者作為研究對(duì)象。分析P16 INK4a蛋白及HPV DNA檢測(cè)對(duì)疾病的預(yù)測(cè)價(jià)值。結(jié)果 P16 INK4a蛋白陽性率在CINⅢ中高于HPV DNA陽性率(χ2=8.78，P＜0.05)，且P16 INK4a蛋白的陽性率與病變程度呈正相關(guān) (r=0.258，P＜0.05)，而HPV病毒陽性率與病變程度呈負(fù)相關(guān) (r=0.530，P＜0.05)。結(jié)論 P16 INK4a蛋白比HPV DNA對(duì)檢測(cè)CINⅢ具有更高的敏感性，所以HPV DNA聯(lián)合P16 INK4a蛋白檢測(cè)對(duì)CIN有更高的預(yù)測(cè)價(jià)值。

宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變;治療;人類乳頭病毒;P16 INK4a蛋白

宮頸細(xì)胞巴氏涂片 (PAP)及液基薄層細(xì)胞檢測(cè) (TCT)目前已普遍應(yīng)用于宮頸癌篩查，尤其PAP已普遍應(yīng)用于發(fā)展中國(guó)家，且90%的宮頸癌是由人乳頭瘤病毒 (HPV)導(dǎo)致，如何更好地檢測(cè)HPV是多年來醫(yī)學(xué)界一直探討的問題。Miriam等［1］研究認(rèn)為:單憑PAP檢查敏感度還不很高，應(yīng)增加HPV DNA檢測(cè)，但HPV DNA感染的短暫性導(dǎo)致HPV DNA的診斷率也很低，而P16 INK4a蛋白在HPV感染后轉(zhuǎn)變中存在高表達(dá)，所以應(yīng)結(jié)合P16 INK4a蛋白檢測(cè)增加其敏感度。在細(xì)胞學(xué)樣本中結(jié)合P16 INK4a蛋白組織學(xué)檢查增加診斷宮頸上皮內(nèi)瘤變 (CIN)的敏感度。有研究顯示，宮頸細(xì)胞學(xué)檢查異常后接受陰道鏡檢查的人群中，免疫組織化學(xué)P16 INK4a蛋白在高級(jí)別病變中陽性率高［2］。本研究選擇2008—2011年在我院經(jīng)陰道鏡檢查診斷為CIN同時(shí)又接受宮頸錐切 (LEEP)手術(shù)治療的患者，對(duì)其P16 INK4a蛋白及HPV DNA檢查結(jié)果進(jìn)行探討，研究?jī)烧邔?duì)宮頸癌前病變的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2008年11月—2011年10月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一人民醫(yī)院松江分院經(jīng)細(xì)胞學(xué)篩查、陰道鏡活檢、組織病理學(xué)診斷為CIN，并根據(jù)病變程度和患者意愿行LEEP治療的705例患者為研究對(duì)象;年齡20～69歲，平均(39.5±9.8)歲。其中CINⅠ:378例、CINⅡ:219例、CINⅢ:108例 (包括原位癌6例)。

1.2 方法

1.2.1 宮頸組織HPV DNA檢測(cè) 應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)儀對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行HPV DNA定性檢測(cè)，HPV DNA 16、18型檢測(cè)按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。檢測(cè)樣本Ct值＜38為陽性。

1.2.2 P16 INK4a蛋白檢測(cè) 取病理存檔臘塊組織標(biāo)本，采用EnVision免疫組化二步法檢測(cè)組織標(biāo)本中的P16 INK4a蛋白情況。試劑由上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司提供，嚴(yán)格按照說明書要求由專業(yè)人員進(jìn)行操作。

1.2.3 免疫組化結(jié)果判定 P16 INK4a蛋白陽性為胞核/胞質(zhì)棕黃色顆粒著色。每張切片選取10個(gè)高倍鏡 (×400)視野，計(jì)數(shù)每500個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)的均值，依據(jù)其陽性率和染色強(qiáng)度判斷結(jié)果。陰性:陽性細(xì)胞數(shù)＜10%或染色強(qiáng)度與背景顏色無明顯差異;陽性:陽性細(xì)胞數(shù)≥10%。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。HPV DNA感染陽性指標(biāo)以檢出率表示，P16 INK4a蛋白陽性染色以陽性率表示，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用Spearm相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P16 INK4a蛋白陽性率在CINⅢ中高于HPV陽性率 (χ2=8.78，P＜0.05，見表1)，且P16 INK4a蛋白的陽性率隨著病變程度的加重而升高，呈正相關(guān) (r=0.258，P＜0.05)，而HPV病毒陽性率隨著病變程度加重而下降，呈負(fù)相關(guān) (r=－0.530，P＜0.05)。

2.2 CINⅢ病理符合率均較CINⅡ與CINⅠ高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=7.58，χ2=5.87;均P＜0.05，見表2)。

表1 治療前各病變程度HPV DNA及P16 INK4a蛋白的陽性率比較Table 1 Comparison of positive rate of the lesion level HPV DNA and P16 INK4a before treatment

表2 HPV DNA及P16 INK4a蛋白檢測(cè)結(jié)果的病理符合率Table 2 Pathological coincedence rate of test results in HPV DNA and P16 INK4a

3 討論

3.1 PAP涂片對(duì)宮頸癌的預(yù)防有很大幫助，然而細(xì)胞學(xué)檢查也存在錯(cuò)誤讀片率，從而降低了60%～70%的敏感度，假陰性結(jié)果對(duì)宮頸病變的漏診及治療造成很大影響［3］，高危型HPV DNA病毒篩查有利于減少假陰性率。雖然婦女生殖道感染高危型人乳頭狀瘤病毒 (hr－HPV DNA)較細(xì)胞學(xué)檢查具有更高敏感度，但因?yàn)樗荒軈^(qū)別HPV DNA短暫性或轉(zhuǎn)換性感染，敏感度仍舊很低。結(jié)合生物標(biāo)志物檢查會(huì)增加其敏感度，預(yù)防過度治療［4－5］。目前研究結(jié)果表明，P16 INK4a蛋白在高級(jí)別病變中存在高敏感度，克服了由于PAP檢測(cè)缺點(diǎn)及HPV DNA檢測(cè)作為HPV DNA短暫性及轉(zhuǎn)變性。Szarewski等［6］通過分析以往資料顯示，P16 INK4a蛋白對(duì)感染過HPV DNA的轉(zhuǎn)換中CIN具有更高敏高度，且高達(dá)81%～100%。

3.2 P16 INK4a蛋白的表達(dá)與宮頸病變密切相關(guān) 采用免疫組化法檢測(cè)P16 INK4a蛋白可廣泛運(yùn)用于細(xì)胞學(xué)檢查，同時(shí)進(jìn)一步區(qū)分未明確意義的不典型鱗形細(xì)胞 (ASCUS)中具有病變的細(xì)胞，Nieh等［7］同樣依靠P16 INK4a蛋白在非典型腺細(xì)胞 (AGC)中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)更加嚴(yán)重的病變從而得出相同的結(jié)論。P16 INK4a蛋白可作為細(xì)胞學(xué)診斷的一個(gè)生物學(xué)標(biāo)記，這與Liu等［8］的研究結(jié)論一致，認(rèn)為P16 INK4a蛋白蛋白細(xì)胞學(xué)中的表達(dá)能夠增加診斷的敏感性和特異性。P16 INK4a蛋白基因是迄今發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)直接作用于細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞分裂的基因。P16 INK4a蛋白基因的缺失、突變和甲基化存在于多種人腫瘤細(xì)胞，提示其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［9］。在宮頸癌的研究中，P16 INK4a蛋白基因在宮頸癌中的表達(dá)與其抑癌基因形象并不相符，P16 INK4a蛋白蛋白在宮頸癌中呈高表達(dá)［3－4］。目前P16 INK4a蛋白與宮頸癌關(guān)系的研究，已成為近年來宮頸癌的研究熱點(diǎn)。P16 INK4a蛋白在宮頸上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化前已出現(xiàn)，并隨著宮頸癌前病變級(jí)別進(jìn)展而增加。有研究認(rèn)為，P16 INK4a蛋白在HPV DNA感染陽性的子宮頸鱗癌中有很高的陽性表達(dá)率，可以誘導(dǎo)P16 INK4a蛋白的過度表達(dá)并使其具有永生性的特點(diǎn)，P16 INK4a蛋白過度表達(dá)可能直接或間接由HPV DNA病毒編碼蛋白E6和E7所誘導(dǎo)，它們可以與P53和PRB結(jié)合并使其活性下降最終導(dǎo)致宮頸覆蓋上皮發(fā)生惡變［7］，P16 INK4a蛋白已經(jīng)被推算作為評(píng)價(jià)CIN及宮頸癌一個(gè)可靠的標(biāo)志［10］。

3.3 當(dāng)前在宮頸病變的治療中，一個(gè)誤區(qū)是將CINⅠ均認(rèn)為是癌前病變，進(jìn)行積極治療。不少學(xué)者認(rèn)為2002年制定的美國(guó)陰道鏡和宮頸病理學(xué)會(huì) (ASCCP)方案存在對(duì)CINⅠ的過度治療。近年來大量臨床資料證實(shí)，CIN未經(jīng)治療即有較高的自然消退率，CINⅠ60%～90%在2年內(nèi)逆轉(zhuǎn)，而且癌變的幾率極低［8，11］。因此，對(duì)于無癥狀、細(xì)胞學(xué)為ASCUS和低度鱗狀上皮內(nèi)病變 (LSIL)，即使轉(zhuǎn)化區(qū)不可見，也不用頸管刮宮，也不必錐切或LEEP，建議嚴(yán)格隨訪。CINⅠ患者可于隨訪觀察，CINⅡ患者觀察的可行性可作為今后研究方向，避免患者進(jìn)行不必要的治療，尤其是有生育要求的患者，HPV DNA結(jié)合P16 INK4a蛋白檢測(cè)對(duì)CIN診斷及治療很大幫助。

3.4 陰道鏡作為隨訪檢查的主要手段發(fā)現(xiàn)，結(jié)合HPV DNA及P16 INK4a蛋白檢查，能更好的預(yù)測(cè)宮頸癌前病變及治療后的隨訪［12］，在今后的治療預(yù)測(cè)和觀察中，可通過細(xì)胞學(xué)檢查同時(shí)將P16 INK4a蛋白檢測(cè)結(jié)合陰道鏡作為重要的檢測(cè)指標(biāo)，可避免不必要的創(chuàng)傷性檢查及治療。

綜上，CINⅠ采取LEEP手術(shù)存在過度治療傾向;CINⅡ中發(fā)現(xiàn)病理升級(jí)率低，也可進(jìn)行隨訪觀察，作為今后研究方向;CINⅢ行宮頸錐切是目前主要治療手段。HPV DNA聯(lián)合P16 INK4a蛋白檢查能更好的預(yù)測(cè)宮頸內(nèi)瘤樣病變。

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Value of Immunocytochemical Staining of P16 INK4a Protein Combined with Human Papillomavirus Test for the Detec-tion of Cervical Intraepithelial Neoplasia

JIN Yan，CAO Shu－jun，YANG Dao－h(huán)ua，et al.Department of Obstetrics and Gynecology，Songjiang Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medcine，Shanghai 201600，China

ObjectiveTo evaluate the value of immunocytochemical staining of P16 INK4a protein combined with human papillomavirus(HPV)test for detecting cervical intraepithelial neoplasia(CIN).Methods Totally 705 patients with pathologically confirmed CIN in our hospital from November 2008 to October 2011 were enrolled in this study.We made a retrospective study of the clinical and pathological data by immunocytochemical staining of P16 INK4a protein combined with HPV test.ResultsThe sensitivity of the positive rate of P16 INK4a in high－grade CIN was significantly higher than that of HPV DNA test(χ2=20.642，P ＜0.05).The positive rate of P16 INK4a protein staining was positively correlated with the pathologic degree of lesions(χ2=38.432，P ＜0.05)，while the positive rate of P16 INK4a test was positively correlated with the pathologic degree(r=0.2580，P＜0.05)the positive rate of HPV DNA test was negatively correlated with the pathologic degree(r=－0.530，P＜0.05).ConclusionThe immunocytochemical staining of p16 INK4a protein has a higher sensitivity than HPV DNA test in detecting high grade CIN，and therefore it，when combined with HPV DNA test，has a high predictive value for CIN.

Cervical intraepithelial neoplasia;Treatment;Human papilloma virus(HPV DNA);P16 INK4a immunostaining protein

R 711.74

A

1007－9572(2012)10－3368－03

10.3969/j.issn.1007－9572.2012.10.054

上海市松江區(qū)醫(yī)學(xué)領(lǐng)先專業(yè)建設(shè)資助項(xiàng)目 (05－Ⅰ－04);上海市松江區(qū)科技攻關(guān)項(xiàng)目

201600上海市，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一人民醫(yī)院松江分院婦產(chǎn)科 (金艷，曹樹軍，施華珍，錢金風(fēng))，病理科(楊道華)

曹樹軍，201600上海市，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一人民醫(yī)院松江分院婦產(chǎn)科;E－mail:shujun－cao@163.com

2012－02－23;

2012－09－10)

(本文編輯:李晨)