胃寧膠囊對(duì)胃潰瘍大鼠胃黏膜EGF及EGFR mRNA表達(dá)的影響

劉敬，趙斌，王瓊，謝朝良

胃潰瘍是消化系統(tǒng)常見疾病，胃寧膠囊用于脾胃氣虛、肝胃不和所致的胃脘疼痛、喜按、嘔吐酸水、胃潰瘍及胃痛見上述癥候者。前期藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明胃寧膠囊具有很好的抗?jié)冏饔茫緦?shí)驗(yàn)通過(guò)研究胃寧膠囊對(duì)大鼠胃黏膜EGF及EGFR mRNA表達(dá)水平的影響，探索其抗?jié)兊淖饔脵C(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品與動(dòng)物

胃寧膠囊（規(guī)格：0.4 g/粒，由成都中醫(yī)藥大學(xué)制劑教研室提供，批號(hào)：100301、100302、100303，三批等量混合使用）；大鼠，SD種，普通級(jí)，體重170.2～190.9 g，雌雄各半（由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證：SCXK(川)2008-11號(hào)）。

1.2 統(tǒng)計(jì)方法

各組數(shù)據(jù)均用x±s表示，采用spss11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法[1]

1.3.1 造模 取健康SD大鼠24只，雌雄各半，按性別隨機(jī)搭配分成3組，每組8只，分別作為：①模型對(duì)照組：純凈水1 mL/100 g體重；②胃寧膠囊治療組：0.6 g.kg-1(濃度為0.06 g.mL-1，給藥容量均為1 mL/100 g體重)。 ③正常對(duì)照組：正常飼養(yǎng)。①、②組動(dòng)物灌胃給藥，每天1次，第5天給藥后禁食不禁水48 h，第7次給藥后4 h, 將大鼠在乙醚麻醉下剖腹，于幽門和十二指腸交界處結(jié)扎，將大鼠行幽門結(jié)扎性胃潰瘍模型，禁食禁水，19 h后放血處死大鼠，取胃黏膜。實(shí)驗(yàn)用器械均以0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的器械消毒液浸泡12 h以上，玻璃器皿則干烤200℃ 5 h以上，滅活RNA酶。正常對(duì)照組于腺胃前壁近幽門處，其余各組沿潰瘍周圍取下約1×1 cm2大小的胃壁，冰生理鹽水沖洗干凈，用無(wú)菌濾紙小心拭干，迅速放入液氮中冷存，用RT-PCR檢測(cè)胃黏膜組織EGF及EGFR mRNA的表達(dá)水平。

1.3.2 總RNA的提取與定量 分別取大鼠胃黏膜，約100 mg置加有1 mLTrizol 裂解液的無(wú)菌離心管中，電動(dòng)勻漿器勻漿，吸取組織裂解液加到1.5 mL無(wú)菌EP管中，室溫放置5 min，Trizol試劑盒法確定總RNA的質(zhì)量及純度。

1.3.3 單鏈cDNA的合成 按照RT-PCR一步法擴(kuò)增試劑盒方法，分別以胃黏膜組織總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。各目的基因的引物序列、產(chǎn)物大小如下: 大鼠EGF特異性引物正義鏈：5′–TCG GTG CTG TGC GAT TTA–3′，反義鏈：5′–TGG TGG GCA GGT GTC TTT–3′，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為367bp；大鼠EGFR特異性引物正義鏈：5′–AGC GAG GCT GAC AAG AAG A–3′，反義鏈：5′–CAC CCG CAC CCT GAT ACA–3′，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為378bp。內(nèi)標(biāo)參照管家基因GAPDH(glyceraldehyde–3–phosphate dehydrogenas)正義鏈：5′–ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC–3′，反義鏈：5′–TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA–3′，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為485bp。RT-PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括0.5 μg.μL-1總RNA 1μL，10×Taq酶緩沖液2.5 μL，dNTPs 2.5 μL，MgCl25 μL, Taq酶、AMV、Inhibitor各0.5 μL，GAPDH引物、EGFR引物各1 μL，溶于8 μL無(wú)RNA酶去離子水中。反應(yīng)條件為：取RT-PCR產(chǎn)物7 μL，以DL2000為Marker, 經(jīng)

1.5%瓊脂糖凝膠90 V電泳30 min，0.5 mg.mL-1溴乙錠溶液染色，凝膠成像分析。以GAPDH作為內(nèi)參照，計(jì)算機(jī)灰度掃描求積定量，用目的基因條帶與

GAPDH灰度比值表示EGF及EGFR mRNA表達(dá)水平。

1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.4.1 胃寧膠囊對(duì)EGF mRNA的影響 與正常組比較，模型組及胃寧膠囊組大鼠胃黏膜組織對(duì)機(jī)體保護(hù)作用的EGF mRNA的表達(dá)水平較正常組明顯上調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，胃寧膠囊組EGF mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01)。結(jié)果見表1。

1.4.2 胃寧膠囊對(duì)EGFR mRNA的影響 與正常組比較，模型大鼠胃黏膜組織對(duì)機(jī)體保護(hù)作用的EGFR mRNA的表達(dá)水平較正常組上調(diào)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，胃寧膠囊組大鼠胃黏膜組織對(duì)機(jī)體保護(hù)作用的EGFR mRNA的表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，胃寧膠囊組EGFR mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 胃寧膠囊對(duì)胃潰瘍模型大鼠胃黏膜EGF及EGFR mRNA表達(dá)水平的影響 ( x±s)

2 結(jié)論

胃寧膠囊能顯著提高大鼠胃黏膜中EGF及EGFR mRNA表達(dá)水平，提示其抗?jié)冏饔门c細(xì)胞因子的介導(dǎo)有關(guān)。

3 討論

消化性潰瘍是臨床常見多發(fā)性疾病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為潰瘍發(fā)生是黏膜侵襲因素和防御因素失衡的結(jié)果。文獻(xiàn)報(bào)道，中藥對(duì)實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍的作用機(jī)制主要從減弱胃潰瘍的攻擊因子、增強(qiáng)胃黏膜防御因子和改善中樞神經(jīng)功能的傳導(dǎo)等方面起作用。本實(shí)驗(yàn)從胃寧膠囊對(duì)大鼠胃黏膜EGF及EGFR mRNA表達(dá)水平影響來(lái)探討其抗?jié)兊淖饔脵C(jī)理。

EGF在維持胃腸黏膜完整性、保護(hù)胃黏膜免受損傷因子破壞方面起著非常重要的作用[2～3]，對(duì)胃潰瘍的發(fā)生、發(fā)展和愈合均有影響。 EGF是一種有效的促分裂素，其主要功能是促進(jìn)細(xì)胞增生，參與胃腸上皮細(xì)胞的增生、成熟、分化，在生理?xiàng)l件下調(diào)節(jié)胃腸道的生長(zhǎng)發(fā)育。此外EGF具有營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)胃腸道作用。黏膜損害和HP（幽門螺桿菌）感染時(shí)胃黏膜EGF蛋白水平和EGFR mRNA的表達(dá)水平增加，而唾液中的EGF的濃度不受影響[4]。潰瘍發(fā)生后EGF等生長(zhǎng)因子表達(dá)水平上調(diào)可以促進(jìn)再生黏膜細(xì)胞遷移進(jìn)入新生肉芽組織，修復(fù)黏膜疤痕中腺體結(jié)構(gòu)[5]，刺激黏膜和/或重碳酸鹽分泌，增加局部血流量，以及釋放多種細(xì)胞保護(hù)因子[6]。EGF是近年發(fā)現(xiàn)的在細(xì)胞增殖和分化中起重要作用的分子[7]，更是再生黏膜功能成熟度的重要指標(biāo)。

EGFR對(duì)EGF有高度特異性和親和力，廣泛存在于多種上皮細(xì)胞膜上。當(dāng)EGF到達(dá)靶細(xì)胞表面時(shí)，很快與細(xì)胞膜上EGFR結(jié)合，誘導(dǎo)其變構(gòu)，形成受體二聚體，激活受體膜內(nèi)區(qū)域的酪氨酸蛋白激酶，使自身的一系列酪氨酸被磷酸化，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與分化。

本研究采用了RT-PCR技術(shù)，探討了胃寧膠囊對(duì)EGF及EGFR mRNA在胃潰瘍大鼠胃黏膜中表達(dá)的干預(yù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)幽門結(jié)扎造模損傷后，模型大鼠胃黏膜組織應(yīng)激刺激，對(duì)機(jī)體保護(hù)作用的EGF及EGFR mRNA的表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比明顯上調(diào)，而胃寧膠囊處理后EGF及EGFR mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步上調(diào)，胃寧膠囊可明顯增強(qiáng)胃潰瘍邊沿上皮EGF及EGFR mRNA的表達(dá)，提示胃寧膠囊的抗?jié)儥C(jī)制可能通過(guò)激活EGF/EGFR系統(tǒng)，增強(qiáng)胃黏膜的保護(hù)作用，而促進(jìn)潰瘍愈合。

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