大孔樹脂富集續斷中總皂苷的測定

李 玲，謝 崢

（荊門市第二人民醫院，湖北 荊門 448000）

續斷又名龍豆、屬折、和尚頭、川續斷等。為川續斷科植物川續斷DipsacusasperWall.exHenry的干燥根。廣泛分布于四川、湖北、云南、西藏等地。資源極為豐富。在《神農本草經》中被列為上品，味苦、辛、微澀，性微溫。功能為補肝腎、養筋骨、通關節、和血脈，安胎止血。生品續筋骨、通血脈力勝，多用于風濕痹痛，跌打損傷；炒用補肝腎、安胎止血力強，多用于腎虛腰痛，崩漏胎滑諸癥。現代研究已經證明續斷中含有生物堿、皂苷類等多種化學成分[1]。本文對續斷中總皂苷進行含量測定。

1 儀器與試藥

UV-VIS L-7240檢測器；UV-754（上海第三分析儀器廠）;RE-52AA旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；AS2060B超聲儀（AUTOSCIENCE）；大孔吸附樹脂DM101（天津農藥股份有限公司樹脂分公司）；川續斷藥材（購自恩施）。

2 實驗方法及結果

2.1 總皂苷的提取

精密稱取80℃干燥后的川續斷藥材1 kg，打成粉末，用95%的乙醇回流提取3次，每次加8倍量乙醇，分別提取至沸騰后計時1.5、1、1 h，過濾，合并濾液，用旋轉蒸發儀回收乙醇并濃縮至小體積，轉入坩堝中水浴揮干，得浸膏，稱重702.7 g，比重0.98。

取6.25 g浸膏水浴揮干，稱重為1 g，蒸餾水定容至100 mL，后不再進行任何處理，作為樣品I；另取50 g浸膏用蒸餾水定容至500 mL，取20 mL作為樣品Ⅱ；另取120 mL溶液分別用110 mL、50 mL、50 mL的水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇層（上層），回收正丁醇至干，用蒸餾水定容150 mL作為樣品Ⅲ。

2.2 DM101大孔樹脂對總皂苷的吸附性能考察

2.2.1 大孔吸附樹脂的預處理 稱取20 g大孔樹脂，用10倍量無水乙醇浸泡24 h，然后用乙醇洗至洗出液∶水=1∶5無白色渾濁現象，再用蒸餾水洗至無醇，濕法裝柱備用。

2.2.2 大孔吸附樹脂吸濕率測定 稱取3份2 g未處理的樹脂，經過預處理后稱重分別為2.2、2.1、2.3 g，計算得出吸濕率為10%。

2.2.3 吸附容量的測定 取1 g續斷干膏制成100 mL水溶液，準確稱取已處理過的大孔樹脂6 g加入續斷水溶液中，進行搖床，定時取樣，進行香草醛反應，測定水溶液中皂苷的含量。根據取樣時間和吸附量做吸附曲線，結果見表1、圖1。

表1 取樣時間和吸附容量

圖1 取樣時間和吸附量的吸附曲線圖

結果表明其吸附時間主要在前9 h，在24 h達到飽和。同時也可以計算出大孔樹脂對總皂苷的吸附量為55.6 mg/g。

2.2.4 大孔樹脂的用量探索 取50 mL續斷的水溶液放入已處理過的4 g大孔樹脂中搖床24 h，過濾、將濾液水浴揮干，稱重1 g，用甲醇定溶至10 mL。另取50 mL續斷的水溶液，水浴揮干，稱重1.3340 g，甲醇定容至10 mL，作為對照品。取樣品和對照品各5 uL，進行香草醛反應，測定其吸光度，計算得到大孔樹脂對總皂苷吸附量為60.2 mg/g，對生藥吸附量為1.007 g/g。

2.3 含量測定方法學考察

2.3.1 對照品溶液的配置 精密稱取黃芪甲苷標準品2.9 mg，用甲醇溶解并定溶于5 mL容量瓶中作為對照品溶液。

2.3.2 最大吸收波長的測定 分別取對照品溶液40 μL和總皂苷溶液40 μL進行香草醛反應顯色后于紫外掃描測定，對照品和樣品均在（532±2）nm處呈現最大吸收。

2.3.3 線性關系考察 分別取黃芪甲苷對照品溶液60、80、120、180、360 uL，水浴揮干溶劑，進行香草醛反應，于532 nm處測定吸收度，根據樣品量（x）和吸收值（Y）可得回歸方程y=15.297x－0.0517，R2=0.999。

2.3.4 精密度考察 精密吸取對照品溶液80 uL，進行香草醛反應，測定吸光度，并重復5次，結果表明精密度良好，RSD為0.75%。

2.3.5 顯色穩定性的考察 取同一對照品80 uL，按項下操作顯色后每隔20 min測定1次吸光度，結果表明，在顯色后60～100 min之間吸收度很穩定（RSD=1.037%），但100 min后隨著時間的延長，吸收度逐漸上升。所以測定應在顯色后50～100 min之間進行。

2.4 解吸附實驗及樣品含量測定

將樣品Ⅱ、Ⅲ分別加入已處理并填裝好的大孔樹脂柱中（濕法上樣），依次用蒸餾水、30%、50%、70%、90%乙醇洗脫至Lieberman反應為陰性為止，收集不同濃度的乙醇洗脫液，濃縮至干，用甲醇定容。進行香草醛反應，測定結果見表2～3。

測定結果表明Ⅱ、Ⅲ樣品的70%、90%乙醇洗脫部分基本不含三萜皂苷成分，而兩者30%、50%乙醇洗脫部分共洗脫了91.03%、96.64%的皂苷，反映了其良好的解吸附能力。計算樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中總三萜皂苷的含量。結果見表4。結果表明，大孔樹脂能夠很好的富集續斷中的總三萜皂苷。

3 討論

續斷是常用中藥，其有效部分為三萜皂苷，但除三萜皂苷外，還含有較多的糖、蛋白質等雜質，影響皂苷的測定，從樣品中除盡又比較困難。因此需要對續斷中的總皂苷進行富集來排除其他因素的干擾。通常對于皂苷的富集采用正丁醇萃取法。由于此法的富集程度有限，作者決定探索一種更好的方法來解決該問題。結果找到了DM101型大孔樹脂并結合正丁醇萃取來處理樣品效果很好，不僅吸附快，解吸也快，對皂苷的吸附具有很好的選擇性。

表2 樣品Ⅱ不同濃度乙醇洗脫部分總皂苷的量

表3 樣品Ⅲ不同濃度乙醇洗脫部分總皂苷的量

表4 樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中總三萜皂苷的含量

在使用樹脂的過程中，需要探索乙醇洗脫的最佳濃度。本文通過使用30%、50%、70%、90%4種不同濃度的乙醇溶液洗脫至Lieberman反應為陰性為止，發現30%、50%的乙醇能洗脫掉90%以上皂苷，具有很強的解吸附能力，可作為總皂苷洗脫的最佳濃度。

對洗脫之后的樣品揮干甲醇定容后便可進行含量測定。參考了文獻資料后對總皂苷的含量通常采用比色法測定，可以消除雜質干擾。實驗結果表明該方法精密度、重現性、穩定性均較好。

[1]Zhong JH,Li CS,Li DD.Progress in research of the active chemical components of Cornus off i cinalis[J].Zhongguo Xinyao Zazhi(Chin J New Drugs),2001,10(11):808-812.