吉非貝齊對人巨噬細胞Kv1.3和Kir2.1表達的差別調節作用及其對膜電位的影響

雷新軍，張 葳，林顯豐，王東琦，袁祖貽，4

（1.西安交通大學醫學院第一附屬醫院心內科，陜西 西安 710061；2.西安交通大學醫學院第一附屬醫院新生兒科，陜西 西安 710061；3.美國印第安納大學醫學院普渡心臟病學研究所，印第安納波利斯 46202；4.西安交通大學環境與疾病相關基因教育部重點實驗室，陜西 西安 710061）

吉非貝齊對人巨噬細胞Kv1.3和Kir2.1表達的差別調節作用及其對膜電位的影響

雷新軍1，張 葳2，林顯豐3，王東琦1，袁祖貽1，4

（1.西安交通大學醫學院第一附屬醫院心內科，陜西 西安 710061；2.西安交通大學醫學院第一附屬醫院新生兒科，陜西 西安 710061；3.美國印第安納大學醫學院普渡心臟病學研究所，印第安納波利斯 46202；4.西安交通大學環境與疾病相關基因教育部重點實驗室，陜西 西安 710061）

目的：探討人巨噬細胞發育過程中Kv1.3、Kir2.1通道的表達和吉非貝齊的調節作用，觀察其對膜電位的影響，為動脈粥樣硬化（AS）相關性疾病治療提供電生理學依據。方法：健康人外周血單核細胞源性巨噬細胞隨機分為對照5d組（C 5d）、對照7.5d組（C 7.5d）和吉非貝齊組（G），吉非貝齊的終濃度為400μmol·L－1；采用Real time RT－PCR及Western blotting技術檢測Kv1.3和Kir2.1通道的表達，電壓敏感染料膜電位標測技術分析膜電位的變化。結果：與C 5d組比較，C 7.5d組 Kv1.3mRNA／蛋白水平從（1.064±0.275）／（0.227±0.018）升高至（3.067±0.824）／（0.409±0.022）（P＜0.05），但 Kir2.1mRNA／蛋白水平卻從（1.024±0.166）／（0.204±0.018）降低至（0.399±0.133）／（0.042±0.008）（P＜0.05）；與 C 7.5d組比較，吉非貝齊組 Kv1.3 mRNA／蛋白水平下降至（1.137±0.067）／（0.143±0.023）（P＜0.01），而 Kir2.1mRNA／蛋白水平卻升高至（1.35±0.087）／（0.202±0.033）（P＜0.01）；吉非貝齊顯著消弱C 5d和C 7.5d組巨噬細胞表面的熒光強度，使其膜電位從（1.000±0.026）分別下降至（0.833±0.046）和（0.481±0.053）（P＜0.05）。結論：吉非貝齊差別調節人單核細胞源性巨噬細胞Kv1.3和Kir2.1通道的表達，并降低巨噬細胞膜電位。

離子通道；膜電位；巨噬細胞；吉非貝齊；細胞分化

目前認為，過氧化物酶體增生物激活受體α（peroxisome proliferator－activated receptor－alpha，PPARα）激動劑吉非貝齊（gemfibrozil）對伴有血脂異常的患者能夠改善心血管臨床轉歸［1］。吉非貝齊不僅通過增加高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL－C）、降低甘油三酯（triglyceride，TG）、上調對膽固醇逆向轉運（reverse cholesterol transport，RCT）關鍵的基因表達［2］等機制減少罹患動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）患者的臨床事件，而且其代謝產物 M1（5－（4－hydroxy－2，5－dimethyl－phenoxy）－2，2－dimethyl pentanoic acid）能劑量依賴性抑制低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）的氧化修飾，減弱氧化修飾低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，OxLDL）的細胞毒性作用［3］。

巨噬細胞通過A族清道夫受體（scavenger receptor class A，SR－A）、B 族 清 道 夫 受 體（scavenger receptor class B，SR－B）如 CD36等無限制攝取氧化脂質導致泡沫細胞形成，是AS斑塊始發與進程中的關鍵環節［4］。抑制巨噬細胞向泡沫細胞分化被認為是抗AS藥物篩選及防治機制研究的重要途徑。研究［5］顯示：吉非貝齊可以顯著減少ApoE（－／－）鼠AS損害面積。但是，其對巨噬細胞的功能和分化有無影響及其可能機制目前尚不清楚。離子通道（ion channel）是細胞維持生命活動的結構基礎。近年來的研究［6－7］表明：電壓依賴性鉀通 道 （voltage－dependent potassium channel，VDPC）Kv1.3和內向整流鉀通道（inward rectifier potassium channel，Kir）Kir2.1在人外周血單核細胞源性巨噬細胞的泡沫化過程中發揮著關鍵的調控作用，有望成為AS防治的一類嶄新的分子靶點。然而，迄今為止國內外尚未見有關吉非貝齊對巨噬細胞Kv1.3和Kir2.1表達及功能影響的報道。本研究采用Real time RT－PCR和 Western blotting技術觀察吉非貝齊對人單核細胞源性巨噬細胞Kv1.3和Kir2.1表達的調節作用，并采用電壓敏感染料膜電位標測技術進一步分析其對巨噬細胞膜電位的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及主要儀器 吉非貝齊購自Sigma公司，RPMI－1640 培養 基 購自 Gibico 公 司，di－4－ANEPPS購自 Molecular Probes公司，兔抗人Kv1.3和Kir2.1多克隆抗體購自 Alomone Labs公司，BCA蛋白定量試劑盒購自陜西先鋒生物技術有限公司，RNAfast200試劑盒購自上海飛捷生物技術有限公司，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kits和Real time PCR Master Mix購自Fermentas公司，UnBlotTM膠內化學發光檢測試劑盒購自Pierce公司。CK40－32P倒置相差顯微鏡為Olympus公司產品；IQ5.0實時定量PCR儀、蛋白垂直電泳槽和蛋白濕轉儀為Biorad公司產品；電泳儀為北京六一公司產品。引物由北京三博遠志生物技術有限公司合成。

1.2 細胞培養 采用密度梯度離心法從健康志愿者獻血、中心血庫機采血小板后的剩余成份中分離單核細胞，培養5d即分化為巨噬細胞。隨機分為3組：①對照5d組（C 5d），不添加任何試劑，即刻收獲；②對照7.5d組（C 7.5d），含10%胎牛血清的RPMI－1640培養基；③吉非貝齊組（G），吉非貝齊的終濃度為400μmo·L－1。后2組細胞于培養60h后收獲。上述細胞均檢測鉀通道表達，而C 5d和C 7.5d組細胞還進一步檢測膜電位。所有實驗中，臺盼藍排除實驗檢測細胞活力均大于95%。

1.3 RNA提取和Real time RT－PCR反應 采用RNAfast200試劑盒提取細胞總RNA和RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kits合成cDNA，Real time PCR Master Mix進行PCR。反應條件：50℃、2min；95℃、10min；95℃、15s，60℃、30s，72℃、30s，共40個循環。循環結束后進行溶解曲線分析，從55℃開始到95℃，每0.5℃讀取數值1次，結果顯示為單一峰。所有PCR產物經3%瓊脂糖凝膠電泳均證實為特異性條帶。各引物序列及擴增產物片段如下：Kv1.3（NM ＿002232.3），F：5′－ACTGCTGGTGCGGTTCTTCG －3′，R：5′－TGTCCATTGCCCTGTCGTTCG－3′，擴 增 產 物 138bp；Kir2.1 （NM ＿000891.2），F：5′－TCAGAAGAAGACGGTATGAAGTTGG－3′， R： 5′－CAGGCAGAAGATAACCAGCATCC－3′，擴 增 產 物 231bp； 內 參β－actin（NM ＿001101.3），F：5′－ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG－3′， R： 5′－AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG－3′，擴增產物179bp。目的基因拷貝數以2－△△c（t）法計算。

1.4 蛋白提取和 Western blotting檢測 收集細胞，加500μL冰預冷的巨噬細胞裂解緩沖液（1%Nonidet P－40，10%glycerol，50mmol· L－1HEPES，pH 7.5，150mmol · L－1NaCl，1mg·L－1抑 肽 酶，1mg· L－1亮 抑 酶 肽，86mg·L－1碘乙酰胺和1mmol·L－1苯甲基磺酰氟化物）裂解細胞。4℃離心，12 000g×10min，吸取上清，測定蛋白濃度后，－80℃保存。上樣前煮沸樣品5min，然后10%SDS－PAGE 100V×1.5h電泳和4℃、30V濕法轉膜過夜。含5%脫脂奶粉的TBS室溫封閉90min后，兔抗人Kv1.3和Kir2.1多克隆抗體孵育，4℃過夜；TBS－T洗滌，15min×4，1∶500二抗室溫孵育1h；增強的化學發光法檢測Kv1.3和Kir2.1。蛋白的表達水平以其與β－actin累積光密度值（IOD）的比值表示。

1.5 電壓敏感染料膜電位標測技術測定膜電位細胞種植于6孔板，實驗開始時吸去培養液并用細胞外液（mmol·L－1：NaCl 140，KCl 4，MgCl21，CaCl22，D－Glucose 5，HEPES 10，NaOH 調節pH值至7.4）清洗1次，然后加入1∶1 000 di－4－ANEPPS 200μL，孵育30s，吸干染料后再加入細胞外液1mL并開始記錄。記錄采用CK40－32P倒置相差顯微鏡，連續拍攝（曝光時間20ms，間隔時間1s），并同時使用Image－pro－plus圖像采集軟件記錄熒光強度的改變。吉非貝齊干預組在拍攝3～7s時給藥并記錄。熒光強度通過LabVIEW 7.1分析軟件轉換為Excel數據并分析。

1.6 統計學分析 以Excel軟件建立數據庫，采用SPSS 13.0統計軟件進行數據統計分析。Kv1.3和Kir2.1mRNA和蛋白的表達水平以x±SE表示，采用方差分析（ANOVA）進行組間比較，比較前進行方差齊性檢驗，組間兩兩比較采用LSD－t檢驗。

2 結 果

2.1 Kv1.3mRNA及蛋白的表達 在巨噬細胞發育過程中，Kv1.3的表達被顯著上調，與C 5d組比較，C 7.5d組巨噬細胞Kv1.3mRNA和蛋白增加分別接近3和2倍，差異有統計學意義（P＜0.05）；而400μmol·L－1吉非貝齊顯著抑制巨噬細胞Kv1.3的表達，同C 7.5d組比較，吉非貝齊組Kv1.3mRNA和蛋白表達下降均超過60%（P＜0.01）。見表1和圖1。

2.2 Kir2.1mRNA及蛋白的表達 在巨噬細胞發育過程中，Kir2.1的表達被顯著下調，同C 5d組比較，C 7.5d組巨噬細胞Kir2.1mRNA和蛋白降低分別超過60%和70%，差異有統計學意義（P＜0.01）；400μmol·L－1吉非貝齊明顯上調 Kir2.1的表達，同C 7.5d組比較，Kir2.1mRNA和蛋白升高分別超過3和4倍（P＜0.01）。見表1和圖1。2.3 巨噬細胞膜電位的變化 400μmol·L－1吉非貝齊顯著消弱C 5d和C 7.5d組巨噬細胞表面的熒光強度（圖2A和2B），使其膜電位從（1.000±0.026）分別下降至 （0.833±0.046）和 （0.481±0.053），差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 人巨噬細胞鉀通道的表達和吉非貝齊的調節作用Tab.1 Expressions of potassium channels in human macrophages and the regulation of gemfibrozil （n＝5，±s）

表1 人巨噬細胞鉀通道的表達和吉非貝齊的調節作用Tab.1 Expressions of potassium channels in human macrophages and the regulation of gemfibrozil （n＝5，±s）

＊P＜0.05compared with C 5dgroup；△P＜0.01compared with C 7.5dgroup.

Group Kv1.3 Kir2.1 mRNA Protein C 5d 1.064±0.275 0.227±0.018 1.024±0.166 0.2 mRNA Protein 04±0.018 C 7.5d 3.067±0.824＊ 0.409±0.022＊ 0.399±0.133＊ 0.042±0.008＊Gemfibrozil 1.137±0.067△ 0.143±0.023△ 1.350±0.087△ 0.202±0.033△

圖1 Western blotting法檢測人巨噬細胞鉀通道蛋白的表達Fig.1 The expression of potassium channel protein in human macrophages detected with Western blotting

3 討 論

貝特類藥物又稱苯氧芳酸類藥物，是指包括吉非貝齊、氯貝特、非諾貝特、苯扎貝特和環丙貝特等在內的一類調脂藥物。盡管其在心血管安全性方面存在著爭議，但是臨床上仍被用來改善心血管危險因素［1］。目前認為：貝特類藥物最主要的獲益人群是以TG、小而密低密度脂蛋白膽固醇 （small dense low density lipoprotein－cholesterol，sdLDL－C）升高和HDL－C降低為特征的AS血脂異常患者，尤其吉非貝齊可能具有比期待更好的心血管益處［8］，對減少冠心病患者心血管疾病剩余風險（residual risk）具有重要意義［9］。

圖2 吉非貝齊作用下人巨噬細胞膜電位的變化Fig.2 Changes of membrane potential in human macrophages after treated with gemfibrozil（n＝12）

研究［3，5］表明：吉非貝齊的代謝產物 M1不僅能以劑量依賴性方式抑制LDL的氧化修飾，減弱OxLDL的細胞毒性作用，而且其還可以顯著減少ApoE （－／－）鼠AS損害面積［5］。巨噬細胞通過清道夫受體 （如SR－A、CD36等）無限制攝取氧化脂質導致泡沫細胞形成，是AS斑塊始發與進程中的關鍵環節［4］。但是，吉非貝齊對巨噬細胞的功能及其分化過程有無影響迄今為止還不清楚。

Vicente等［11］發現：原代培養的鼠骨髓源巨噬細 胞 （bone marrow－derived macrophages，BMDMs）存在外向延遲和內向整流鉀電流，分別由Kv1.3和Kir2.1攜帶，其在鼠BMDMs增殖及活化的過程中表現為不同的調節方式；rMargatoxin－Kv1.3阻斷劑，能劑量依賴性地阻斷外向鉀電流而抑制鼠BMDMs增殖和活化，而Ba2＋－Kir2.1 阻 斷 劑 和 rMargatoxin 具 有 協 同 效應［10］。本課題組前期研究［6－7］證實：人單核細胞源巨噬細胞及其分化形成的泡沫細胞上均有Kv1.3和Kir2.1的表達，rMargatoxin和BaCl2均能顯著減少巨噬細胞內CE的含量而抑制泡沫細胞的分化，表明Kv1.3和Kir2.1在人巨噬細胞源性泡沫細胞分化的過程中發揮著關鍵的調控作用。

本研究以人外周血單核細胞源性巨噬細胞為研究對象，觀察吉非貝齊對Kv1.3、Kir2.1表達的影響，結果顯示：在巨噬細胞發育過程中，吉非貝齊 （400μmol·L－1）差別調節 Kv1.3和 Kir2.1的表達，Kv1.3mRNA和蛋白表達下降均超過60%，而Kir2.1mRNA和蛋白表達顯著上調，分別超過3和4倍。VDPC的差異調節是決定特異性巨噬細胞反應的細胞內信號的關鍵因素。在白細胞外向鉀電流有助于去極化后膜電位的恢復，而內向鉀電流在超極化后發揮著關鍵的作用。研究［11－12］表明：Kv1.3電流設置膜電位在－50～－60mV，而Kir2.1能使膜電位下降的更低，極大增加Ca2＋內流的程度。Ca2＋內流能激活神經鈣蛋白，轉錄因子NF－IL2A，有絲分裂原激活蛋白Ⅱ激酶和DNA合成促進因子的易位子［13－14］。因此，吉非貝齊差別調節Kv1.3和Kir2.1表達可能對巨噬細胞的增殖及活化具有重要的調控作用。

本研究中電壓敏感染料膜電位標測技術結果顯示：吉非貝齊顯著消弱C 5d和C 7.5d組巨噬細胞表面的熒光強度，使其細胞膜電位分別下降了約17%和52%，提示除PPARα激動效應外，吉非貝齊還可能充當一種鉀離子通道阻斷劑對其靶細胞發揮藥理學效應。

綜上所述，吉非貝齊不僅可以調節血脂，而且還可能通過差別調節Kv1.3和Kir2.1表達來調控巨噬細胞的增殖、活化過程，減少泡沫細胞的形成和減輕AS血管壁炎癥損傷［15］。未來的研究需要進一步闡明吉非貝齊對Kv1.3和Kir2.1電生理特征的影響以及調控巨噬細胞增殖、活化的分子／信號轉導機制。

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Differential regulation of Kv1.3and Kir2.1expression by gemfibrozil in human macrophages and its effects on their membrane potentials

LEI Xin－jun1，ZHANG Wei2，LIN Xian－feng3，WANG Dong－qi1，YUAN Zu－yi1，4
（1.Department of Cardiology，First Affiliated Hospital，College of Medicine，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China；2.Department of Pediatrics，First Affiliated Hospital，College of Medicine，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China；3.Krannert Institute of Cardiology and Division of Cardiology，School of Medicine，Indiana University，IN 46202，USA；4.Key Laboratory of Environment and Gene Related to Diseases，Ministry of Education，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China）

Objective To explore the development change of Kv1.3and Kir2.1channels in human macrophages and the effects of gemfibrozil on both channels’expression and their membrane potentials，which will provide electrophysiologic basis for its treating atherosclerotic diseases.Methods The obtained human monocyte－derived macrophages were randomly divided into 3groups：control 5dgroup（C 5d），control 7.5dgroup（C 7.5d）and gemfibrozil group（G）.The final concentration of gemfibrozil was 400μmo·L－1.The effect of gemfibrozil on the expressions of Kv1.3and Kir2.1channels was investigated using Real time RT－PCR and Western blotting，and its effect on membrane potentials was analyzed with the optical mapping of the membrane potential with the voltagesensitive dyes.Results Compared with C 5dgroup，the expressions of Kv1.3mRNA／protein in C 7.5dgroup were raised from （1.064±0.275）／（0.227±0.018）to （3.067±0.824）／（0.409±0.022）（P＜0.05），but the expressions of Kir2.1mRNA／protein were decreased from （1.024±0.166）／（0.204±0.018）to（0.399±0.133）／（0.042±0.008）（P＜0.05）.Compared with C 7.5dgroup，the expressions of Kv1.3mRNA／protein in gemfibrozil group were reduced to（1.137±0.067）／（0.143±0.023）（P＜0.01）；however，the expressions of Kir2.1mRNA／protein were elevated to（1.35±0.087）／（0.202±0.033）（P＜0.01）.Meanwhile，gemfibrozil significantly reduced the surface fluorescence intensity of the macrophages，and the membrane potentials in C 5dand C 7.5dgroups were decreased from （1.000±0.026）to （0.833±0.046）and （0.481±0.053），respectively （P＜0.05）.Conclusion Gemfibrozil differentially regulates the expressions of Kv1.3and Kir2.1channels in human monocytederived macrophages，and lowered their membrane potentials.

ionic channel；membrane potential；macrophage；gemfibrozil；cell differentiation

R363.21

A

1671－587Ⅹ（2012）05－0845－05

2012－07－06

國家自然科學基金資助課題 （81170276）；陜西省科技廳自然科學基金資助課題 （2009JM4006）；西安交通大學醫學創新基金資助課題 （JH0203111）

雷新軍 （1970－），男，山西省平遙縣人，主治醫師，醫學博士，主要從事動脈粥樣硬化發病機制的研究。

袁祖貽 （Tel：029－85324021，E－mail：zuyiyuan＠mail.xjtu.edu.cn）