流式細胞藥敏試驗在肺癌化療中的應用

江永青，胡志堅，盧 敏，韓 峰，荀春華

(九江學院附屬醫院，江西 九江 332000)

全世界每年有超過100萬人死于肺癌，國內肺癌的發病率和死亡率占城市惡性腫瘤的首位。合理化療是有效抑制腫瘤發展，提高患者生命質量、延長生存期的重要途徑。然而，目前腫瘤藥物敏感實驗常用MTT 法，此方法持續時間長、干擾因素多、且難以量化，以至醫生難以及時準確用藥。此外，目前藥敏標本常來源于手術切除物，但大多肺癌患者就診時已錯過最佳手術期。為此我們采試用快速、準確的流式細胞術對纖支鏡標本進行腫瘤藥敏試驗，為臨床醫生根據個體差異選擇治療方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2010-2011年在本院住院的患者92例，其中男61例，女31例，年齡46-78歲，經病理及影像學檢查證實為非小細胞肺癌者。根據患者用藥情況，將其分成兩組：實驗組48例(經藥敏實驗指導給藥)和對照組44例(根據醫生經驗給藥)，兩組的病情、性別、年齡、飲食習慣、職業及文化程度均無顯著性差異。

1.2 方法 標本在取出后，應用機械法將其分離成單細胞懸液，用不連續密度梯度離心法純化細胞，應用流式細胞儀的凋亡檢測技術檢測活細胞數>90%。細胞重懸于10%胎牛血清的RPMI 1640 培養液(含10%胎牛血清，100 IU／ml 青霉素及鏈霉素)，將細胞濃度調至1×105個/ml，接種24 孔板，每孔300μl細胞懸液，每種藥物及組合設5個平行復孔。根據血藥濃度將化療藥物分別加入各孔，分別長春瑞濱(NVB，2.40μg/ml),紫杉醇(PTX,3.60μg/ml),多西紫杉醇(DT,5.00μg/ml),吉西他濱(GEM,46.00μg/ml)，順鉑(CDDP,400.00μg/ml)，卡鉑(CBP,100.00μg/ml)，依托泊苷(VP-16,9.40μg/ml),長春瑞濱 (2.40μg/ml)+順鉑 (400.00μg/ml),依托泊苷(9.40μg/ml)+順鉑(400.00μg/ml),吉西他濱(46.00μg/ml)+順鉑 (400.00μg/ml)。加藥后12h 收獲細胞約1×105個移人試管，PBS 洗滌1次，400μl Binding Bufer 重懸細胞。取200μl細胞懸液加入Annexin V5μl，PI10μl 避光20min，加入200μl Binding Buffer 上機檢測。用Cellquest軟件獲取數據，Mod-Fit軟件進行數據分析得出每組的凋亡率。腫瘤細胞凋亡率=加藥組凋亡率-對照組凋亡率。根據藥敏結果選擇凋亡率最高的藥物或藥物組合，指導臨床用藥。根據RECIST 標準對兩組進行療效評價，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩定(SD)和進展(PD)，以CR+PR 計算有效率(RR)。

1.3 統計學方法 應用SPSS16.0軟件進行統計學分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥敏試驗結果 非小細胞肺癌細胞經單藥和聯合用藥的體外藥敏試驗結果，見表1。

表1 非小細胞肺癌細胞經單藥和聯合用藥的體外藥敏比較

2.2 治療效果比較 實驗組與對照組治療效果比較，見表2。

表2 兩組治療效果比較[n(%)]

3 討論

化療是肺癌治療中重要環節，尤其是在消除肺癌的微轉移灶，控制中晚期肺癌的遠處轉移方面具有不可替代的作用，是多學科治療中一個主要的重要組成部分。目前肺癌化療單藥有100 多種，臨床醫師在制定化療方案時多根據經驗用藥，但由于腫瘤患者個體差異較大，不同類型的腫瘤對藥物的敏感性亦不相同，即便是同一類型也存在著較大差異，由此導致化療效果并不太理想。而腫瘤細胞體外化療藥物敏感試驗的開展，對選擇敏感化療藥物、實現對腫瘤患者的個體化治療、減少盲目性和耐藥的發生具有極其重要的臨床意義。Sargent[2]總結了十多年的腫瘤藥敏結果，發現卵巢癌體外試驗結果與體內應用結果具相關性，且體外敏感藥和不敏感藥進行治療后的5年生存率，前者高于后者。Von Hof[3]報道腫瘤體外藥敏試驗結果與體內療效符合率為84.7%，陽性結果符合率為92.2%，陰性結果符合率為69.1%。這都說明了腫瘤藥敏試驗結果對臨床用藥的指導意義。理想的藥物敏感試驗應具備的條件是簡單、快速、敏感，可篩選作用方式不同的藥物。Schrag D[4]等認為不管何種技術，體外實驗結果一定要與藥物體內療效有較好的符合率。

然而，目前腫瘤藥物敏感實驗常用MTT 法，此方法所獲結果受多方因素的影響，如各復孔間誤差、加藥濃度、加藥時間、MTT 作用時間、溶解劑作用時間等。MTT 法持續時間長、干擾因素多、且難以量化，以至醫生難以及時準確用藥。由于臨床上用于腫瘤治療的大多數抗癌藥物都可在不同類型的腫瘤治療中誘導腫瘤細胞凋亡，誘導細胞凋亡可能是決定化療效果的重要因素[5,6]，而流式細胞術檢測凋亡快速、準確，使其在臨床腫瘤藥敏試驗的應用成為必然趨勢。姚靜[7]等對抗腫瘤藥物敏感性的實驗方法進行比較,結果發現流式細胞術可以檢測到早期凋亡，檢測到藥物最大殺傷率的有效時間點明顯早于MTT比色法。

此外，目前藥敏標本常來源于手術切除物，但大多肺癌患者就診時已錯過最佳手術期。本次試驗以纖支鏡標本為試驗對象，可增加試驗者范圍，減少患者取材的痛苦，又可充分發揮流式細胞術所需標本量少的優勢。

我們用快速、準確的流式細胞術對纖支鏡標本進行肺癌體外藥敏試驗，以指導臨床合理用藥。試驗結果顯示，各種化療藥物的敏感度不同，而且沒有對所有病人都敏感的藥物，因此每種藥物對個體病人的有效性不一。實驗組的有效率為72.91%，明顯高于對照組(40.91%),表明針對個體組成的合理化療方案對病情的控制明顯高于僅憑經驗的普通化療方案。因此我們應篩選出較敏感的化療藥物，組成合理的化療方案，將化療具體到每一個肺癌病人，指導臨床治療，爭取取得最佳的診療效果，以延長患者生存期和改善生活質量。

[1]喬亞峰，葉振東，張國雄，等.血培養常見病原菌的分布及耐藥性分析[J].實驗與檢驗醫學,2011,29(2):136-137.

[2]Sargent JM.The use of the MTT assay to study drug resistance infresh tumour samples[J].Cancer Res，2003，161(1) ∶13-25.

[3]Von Hoff DD.In vitro predictive testing:the sulfonamide era[J].Int J Cell Cloning.1987.5(3):179-190.

[4]Schrag D,Garewal HS,Burstein HJ,et al.American society of clinical oncology technology assessment:chemotherapy sensitivity and resistance assays[J].Clin Oncol,2004,22:3631-3638.

[5]Debatin KM.Apoptosis pathways in cancer and cancer therapy[J].Cancer Immunol Immunother，2004，53：153-159.

[6]Hu W,Kavanagh JJ.Anticancer therapy targeting the apoptotic pathway[J].Lancet Oncol,2003,4(12):721.

[7]姚 靜,李小蘭,李偉華,等.抗腫瘤藥物敏感性實驗方法的比較.中華實驗外科雜志[J]，2005，7：792-793.