注射用尿多酸肽的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法

劉麗梅，武玉虹，姚紅誼

注射用尿多酸肽是采用現(xiàn)代生物技術(shù)從健康人的尿液中提取 純化制得的，含多種有機(jī)酸和相對(duì)分子質(zhì)量小于6 000的多肽等組成的活性物質(zhì)，加適量賦形劑經(jīng)冷凍、干燥制成的凍干粉針劑。為控制熱原，參考2010年版《中國(guó)藥典(二部)》[1]，用不同廠家的鱟試劑對(duì)3批樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 藥品與試劑

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(WSE):批號(hào)為1005210，規(guī)格為10 EU/支，湛江安度斯生物有限公司。鱟試劑(TAL):批號(hào)為1106202、靈敏度為 0.5EU/mL、規(guī)格為0.1mL/支，批號(hào)為 1106271 和1108222，靈敏度為0.25EU/mL、規(guī)格為0.1mL/支，湛江安度斯生物有限公司;批號(hào)為 1101200，靈敏度為 0.25EU/mL，規(guī)格為 0.1mL/支，湛江博康海洋生物有限公司。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET用水):批號(hào)為1104130，內(nèi)毒素含量小于 0.015 EU/mL，規(guī)格為 2 mL/支，湛江安度斯生物有限公司。注射用尿多酸肽:規(guī)格為1 g(以多肽含量計(jì)，下同)，批號(hào)為 S110601，S110602，S110603，自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 TAL靈敏度復(fù)核

根據(jù) TAL 靈敏度標(biāo)示值(λ =0.5 EU/mL，λ =0.25 EU/mL)，將WSE用BET用水溶解，置旋渦混合器上混合15 min，制成質(zhì)量濃度為 1.0，0.5，0.25，0.125，0.0625 EU/mL 的 WSE 標(biāo)準(zhǔn)溶液。按2010年版《中國(guó)藥典(二部)》細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定，復(fù)核4批TAL的靈敏度。結(jié)果靈敏度實(shí)測(cè)值(λC)在0.5λ～2.0λ之間，4批TAL靈敏度均符合規(guī)定，可用于試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 TAL靈敏度復(fù)核結(jié)果

2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)計(jì)算

計(jì)算公式為 L=K/M，式中 K為人每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑 K=5 EU/(kg·h);M為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量，參考尿多酸肽注射液用法用量，注射用尿多酸肽成人每小時(shí)最高劑量為2 g[2－3]，成人體重按60 kg 計(jì)，則 M=2 000/60=33.33 mg/(kg·h)。代入公式，L=5/33.33=0.15 EU/mg。

2.3 供試品有效測(cè)試濃度(C)計(jì)算[1]

根據(jù)最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)=CL/λ，取 MVD=1，則 C=λ/L。目前市售的鱟試劑 λ在0.03～1.0 EU/mL，以TAL靈敏度0.03 EU/mL為基準(zhǔn)，供試品相應(yīng)的有效測(cè)試質(zhì)量濃度 C=0.03/0.15=0.20 g/L;以 TAL 靈敏度 1.0 EU/mL 為基準(zhǔn)，供試品相應(yīng)的有效測(cè)試質(zhì)量濃度 C=1.0/0.15=6.67 g/L;因此，供試品的有效測(cè)試質(zhì)量濃度范圍為0.20～6.67 g/L。

2.4 干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)[1]

取供試品1批，先用BET用水10 mL溶解，再稀釋10倍后作為原液(10 g/L)，然后按 3，6，12.5，25 倍的梯度稀釋?zhuān)?3.33，1.67，0.80，0.40 g/L 4 種質(zhì)量濃度的稀釋溶液(NPC)，接著以供試品各稀釋溶液將WSE稀釋成含細(xì)菌內(nèi)毒素2λ的系列內(nèi)毒素溶液(PPC)，對(duì)1批λ為0.5 EU/mL的TAL作干擾試驗(yàn)，并同時(shí)作陽(yáng)性和陰性對(duì)照。結(jié)果表明，供試品溶液在質(zhì)量濃度不超過(guò)1.67 g/L時(shí)不干擾試驗(yàn)，見(jiàn)表2。

表2 細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

2.5 干擾試驗(yàn)[1]

分別以BET用水和3批以BET用水稀釋為1.67 g/L的供試品溶液，將 WSE 稀釋成含細(xì)菌內(nèi)毒素 2.0λ，1.0λ，0.5λ，0.25 λ共4種濃度的系列內(nèi)毒素溶液，對(duì)3批λ為0.25 EU/mL的TAL作干擾試驗(yàn)，同時(shí)作陰性對(duì)照。結(jié)果 ES均在0.5λ～2.0λ范圍內(nèi)，且 Et均在 0.5 ES～2.0 ES范圍內(nèi)，見(jiàn)表 3。表明 3 批供試品溶液在該質(zhì)量濃度下均不干擾兩個(gè)廠家生產(chǎn)的鱟試劑內(nèi)毒素檢查，確認(rèn)供試品對(duì)鱟試劑檢查無(wú)干擾。

表3 細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

干擾試驗(yàn)結(jié)果表明，注射用尿多酸肽質(zhì)量濃度稀釋至1.67g/L(以多肽含量計(jì))及以下時(shí)，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無(wú)干擾;而供試品溶液質(zhì)量濃度為3.33 g/L時(shí)有干擾，呈抑制作用。

按2010年版《中國(guó)藥典(二部)》細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定計(jì)算，注射用尿多酸肽的細(xì)菌內(nèi)毒素限值為0.15 EU/mg(以多肽含量計(jì))，供試品稀釋至1.67 g/L用標(biāo)示靈敏度0.25 EU/mL的鱟試劑可以檢查其細(xì)菌內(nèi)毒素限值。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄99－附錄102.

[2]YBH10692004，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)(試行)·尿多酸肽注射液[S].

[3]WS1－(X－005)－2008Z，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)·尿多酸肽注射液[S].