注射用尿多酸肽的細菌內毒素檢查方法

劉麗梅，武玉虹，姚紅誼

注射用尿多酸肽是采用現代生物技術從健康人的尿液中提取 純化制得的，含多種有機酸和相對分子質量小于6 000的多肽等組成的活性物質，加適量賦形劑經冷凍、干燥制成的凍干粉針劑。為控制熱原，參考2010年版《中國藥典(二部)》[1]，用不同廠家的鱟試劑對3批樣品的細菌內毒素檢查方法進行了研究，現報道如下。

1 藥品與試劑

細菌內毒素工作標準品(WSE):批號為1005210，規格為10 EU/支，湛江安度斯生物有限公司。鱟試劑(TAL):批號為1106202、靈敏度為 0.5EU/mL、規格為0.1mL/支，批號為 1106271 和1108222，靈敏度為0.25EU/mL、規格為0.1mL/支，湛江安度斯生物有限公司;批號為 1101200，靈敏度為 0.25EU/mL，規格為 0.1mL/支，湛江博康海洋生物有限公司。細菌內毒素檢查用水(BET用水):批號為1104130，內毒素含量小于 0.015 EU/mL，規格為 2 mL/支，湛江安度斯生物有限公司。注射用尿多酸肽:規格為1 g(以多肽含量計，下同)，批號為 S110601，S110602，S110603，自制。

2 方法與結果

2.1 TAL靈敏度復核

根據 TAL 靈敏度標示值(λ =0.5 EU/mL，λ =0.25 EU/mL)，將WSE用BET用水溶解，置旋渦混合器上混合15 min，制成質量濃度為 1.0，0.5，0.25，0.125，0.0625 EU/mL 的 WSE 標準溶液。按2010年版《中國藥典(二部)》細菌內毒素檢查法規定，復核4批TAL的靈敏度。結果靈敏度實測值(λC)在0.5λ～2.0λ之間，4批TAL靈敏度均符合規定，可用于試驗。結果見表1。

表1 TAL靈敏度復核結果

2.2 細菌內毒素限值(L)計算

計算公式為 L=K/M，式中 K為人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑 K=5 EU/(kg·h);M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，參考尿多酸肽注射液用法用量，注射用尿多酸肽成人每小時最高劑量為2 g[2－3]，成人體重按60 kg 計，則 M=2 000/60=33.33 mg/(kg·h)。代入公式，L=5/33.33=0.15 EU/mg。

2.3 供試品有效測試濃度(C)計算[1]

根據最大有效稀釋倍數(MVD)=CL/λ，取 MVD=1，則 C=λ/L。目前市售的鱟試劑 λ在0.03～1.0 EU/mL，以TAL靈敏度0.03 EU/mL為基準，供試品相應的有效測試質量濃度 C=0.03/0.15=0.20 g/L;以 TAL 靈敏度 1.0 EU/mL 為基準，供試品相應的有效測試質量濃度 C=1.0/0.15=6.67 g/L;因此，供試品的有效測試質量濃度范圍為0.20～6.67 g/L。

2.4 干擾試驗預試驗[1]

取供試品1批，先用BET用水10 mL溶解，再稀釋10倍后作為原液(10 g/L)，然后按 3，6，12.5，25 倍的梯度稀釋，得 3.33，1.67，0.80，0.40 g/L 4 種質量濃度的稀釋溶液(NPC)，接著以供試品各稀釋溶液將WSE稀釋成含細菌內毒素2λ的系列內毒素溶液(PPC)，對1批λ為0.5 EU/mL的TAL作干擾試驗，并同時作陽性和陰性對照。結果表明，供試品溶液在質量濃度不超過1.67 g/L時不干擾試驗，見表2。

表2 細菌內毒素干擾試驗預試驗結果

2.5 干擾試驗[1]

分別以BET用水和3批以BET用水稀釋為1.67 g/L的供試品溶液，將 WSE 稀釋成含細菌內毒素 2.0λ，1.0λ，0.5λ，0.25 λ共4種濃度的系列內毒素溶液，對3批λ為0.25 EU/mL的TAL作干擾試驗，同時作陰性對照。結果 ES均在0.5λ～2.0λ范圍內，且 Et均在 0.5 ES～2.0 ES范圍內，見表 3。表明 3 批供試品溶液在該質量濃度下均不干擾兩個廠家生產的鱟試劑內毒素檢查，確認供試品對鱟試劑檢查無干擾。

表3 細菌內毒素干擾試驗結果

3 討論

干擾試驗結果表明，注射用尿多酸肽質量濃度稀釋至1.67g/L(以多肽含量計)及以下時，對細菌內毒素檢查無干擾;而供試品溶液質量濃度為3.33 g/L時有干擾，呈抑制作用。

按2010年版《中國藥典(二部)》細菌內毒素檢查法規定計算，注射用尿多酸肽的細菌內毒素限值為0.15 EU/mg(以多肽含量計)，供試品稀釋至1.67 g/L用標示靈敏度0.25 EU/mL的鱟試劑可以檢查其細菌內毒素限值。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄99－附錄102.

[2]YBH10692004，國家食品藥品監督管理局標準(試行)·尿多酸肽注射液[S].

[3]WS1－(X－005)－2008Z，國家食品藥品監督管理局國家藥品標準·尿多酸肽注射液[S].