多克隆同步篩選及驗證胰腺癌肺轉移細胞亞群

田文嘉 杜洪震 卞曉翠 李開龍

(中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院病理學系，北京 100005)

胰腺癌是消化道系統預后最差的惡性腫瘤之一，轉移是胰腺癌患者死亡的主要原因之一〔1，2〕。現有研究表明，在胰腺癌發生和發展過程中有多個基因突變，包括12個關鍵的信號傳導途徑，如TGF-β信號途徑、鳥嘌呤三磷酸酶(GTPase)依賴的信號途徑、Wnt/Notch信號途徑和JNK信號途徑等〔3〕，說明胰腺癌的發生、發展和轉移是多基因、多信號途徑參與的復雜的生物過程。因此，發現和驗證與胰腺癌轉移有因果關系的基因和信號途徑對胰腺癌的診斷和治療有重要意義。本實驗結合全基因組基因突變技術和小鼠功能篩選，利用多克隆同步篩選和驗證胰腺癌肺轉移細胞亞群，從而得到與胰腺癌轉移有高度關聯的基因。

1 材料與方法

1.1 胰腺癌肺轉移細胞亞群篩選前期基礎 本實驗室前期工作已經采用全基因組隨機基因敲除技術平臺 (RHKO)在人類胰腺癌細胞株AsPC-1建立了全基因組隨機突變文庫。RHKO的原理是通過能在真核細胞中高效整合的piggyBac轉座子構建基因搜尋載體 (Gene Search Vector，GSV)，并將其隨機插入基因組中，造成全基因組范圍內的隨機基因突變。在轉錄激活因子tTA的作用下，GSV中的TRE反應元件被激活，進而啟動附近基因的轉錄。轉錄激活子tTA與TRE的結合還受到強力霉素 (Doxycycline，DOX)的調控，通過添加或者不添加DOX能夠實現人為控制tTA是否激活TRE而啟動附近基因的轉錄。此外，GSV中還包含新霉素抗性基因，使轉入GSV的真核細胞可以利用G418篩選陽性克隆。利用這一技術建立了一個含約110萬隨機基因的突變文庫，進而通過裸鼠轉移模型篩選具有肺轉移特性的AsPC-1細胞亞群，初步篩選和原代培養得到45個肺轉移細胞克隆，利用Splinkette PCR的方法從具有高轉移特性的細胞株中克隆GSV插入位點，從中得到16個候選基因。

1.2 細胞培養 AsPC-1細胞培養采用HyClone公司的DMEM高糖培養基，加入10%的胎牛血清和100 U/ml的青霉素以及0.1 mg/ml鏈霉素。45個高轉移的AsPC-1細胞克隆M1，M2，M3……M45分別培養至對數生長期，各取1×105個細胞混合至15 cm的培養皿中，放于含有5%CO2的37℃恒溫孵箱中，待細胞生長至對數生長期，胰酶消化、離心、收集細胞，PBS漂洗2次，離心后重懸并計數細胞，1×106個細胞/只，采用尾靜脈注射的方式注射到兩組裸鼠體內。

1.3 動物 SPF級別4～6周齡雌性裸鼠(BALB/C nu/nu)，使用前裸鼠適應動物房的環境1 w，減少外界環境對實驗的影響。實驗動物分為加入強力霉素(+Dox)和不加強力霉素(-Dox)兩組，每組8只。+Dox組動物的飲水中加入強力霉素(終濃度為200μg/ml)，由于強力霉素在光照條件下容易分解，所以+Dox組動物的飲水器用錫箔紙包裹以遮蔽光線。

1.4 原代培養 一旦裸鼠出現病態體征，如:行動緩慢、呼吸異常、體形消瘦、神情低迷、反應性差等，立即處死，碘酒消毒，在通風櫥內取出肺臟(圖1)。在玻璃皿內用PBS清洗數次以盡可能洗去血漬。用手術刀將肺組織切碎，用含有600μg/ml G418(CALBIO-CHEM)的DMEM培養基懸浮碎塊至20 ml離心管，1 200 r/min離心5 min后，棄上清，加入15 ml紅細胞裂解液，重懸組織碎塊，靜置裂解紅細胞10 min。1 200 r/min離心5 min，棄上清，用PBS清洗并1 200 r/min離心5 min，棄去上清后用培養基重懸組織碎塊，并將其轉移至10 cm培養皿中。第二天更換培養基，去除未貼壁的懸浮組織碎塊，并加入新鮮培養基。5 d后，加入G418篩選轉移到肺組織的AsPC-1細胞。3～5 d換1次液并加入G418，大約2 w后，培養皿內可見散在的AsPC-1細胞克隆，消化后擴大培養。每只裸鼠的肺臟用兩個10 cm的培養皿分別培養，一個培養皿用于細胞凍存，另一個培養皿用于基因組DNA的提取。細胞培養于含有5%CO2的37℃恒溫孵箱中。

1.5 提取基因組DNA 待細胞生長至對數生長期，PBS漂洗2次，根據威格拉斯基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA。提取基因組DNA后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA，同時利用紫外分光光度計測定DNA的濃度和純度。

1.6 基因組PCR 根據高轉移性細胞株中GSV插入位點的測序結果和GSV的序列結構，設計基因的引物。引物序列設計如下:SQSTM1:5'CCT GAA GCT CTA CAA ACA AGG AAT ATT TCA 3'，PB:5'TTT TACGCA TGA TTA TCT TTA ACGTAC GTC 3'，反應產物長度SQSTM1為525 bp，1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增DNA片段。

2 結果

前期大規模篩選得到45個AsPC-1人胰腺癌肺轉移細胞亞群，為進一步篩選和驗證具有肺轉移能力的細胞亞群，從每個細胞亞群各取105細胞混合形成混合細胞亞群庫。混合庫細胞分別尾靜脈接種兩組小鼠:一組飲用水中加強力霉素，另一組飲用水中不加強力霉素。50～73 d后，分別取每只小鼠肺進行原代培養得到具有肺轉移能力的胰腺癌細胞亞群(圖1，圖2)，共得到16個細胞亞群，每組得到8個細胞亞群。體內多克隆篩選和原代培養，加強力霉素組培養出較多的細胞克隆，而不加強力霉素組培養出的細胞克隆數較少。利用16對特異基因定位DNA引物PCR分析了16個細胞亞群。PCR分析結果顯示+Dox組，肺轉移原代培養有3只小鼠檢測到 SQSTM1基因細胞亞群 (37.5%)，而-Dox組有6只小鼠檢測到SQSTM1基因細胞亞群 (75.0%，圖3)。PCR分析SEMA4B，UBE2K和GNA13基因在16只小鼠都為陰性。檢測表明，強力霉素介導的SQSTM1基因表達能導致不同的胰腺癌肺轉移能力。

圖1 +Dox組和－Dox組裸鼠的生存曲線

圖2 +Dox組和－Dox組裸鼠的肺臟

圖3 +Dox組和－Dox組裸鼠中SQSTM1表達情況

3 討論

目前，胰腺癌的臨床治療手段主要是早期手術切除加術后放、化療，針對胰腺癌細胞生長和轉移特性的多種藥物已經廣泛應用于臨床治療，在一定程度上改善了胰腺癌病人的生存質量和預后，但胰腺癌的死亡率依然沒有明顯改善。腫瘤轉移是胰腺癌病人的主要死亡原因，因此，找出控制胰腺癌轉移的關鍵基因就顯得尤為重要。

本實驗選用分化好、惡性程度相對低的AsPC-1人胰腺癌細胞系為研究對象，采用全基因組隨機基因敲除技術平臺〔4〕的方法，尋找將低轉移性AsPC-1細胞轉變為高轉移細胞的關鍵基因，以期為臨床上早期診斷、早期治療提供新的作用靶點。

在本實驗室前期工作篩選得到的16個候選基因的基礎上，本研究利用裸鼠體內篩選和基因組 PCR的方法，篩選出SQSTM1是在胰腺癌肺轉移過程中的關鍵基因之一。多項研究表明SQSTM1具有調控細胞多種功能的作用。SQSTM1能夠通過抑制有絲分裂信號傳導而阻礙脂肪細胞的分化，能夠通過控制破骨細胞的生成而調節骨的重塑〔4，5〕。SQSTM1能夠調節神經生長因子受體內部化、蛋白定位以及通過調節NF-κB途徑而在Ras誘導的細胞轉化中起一定的作用〔6，7〕。SQSTM1還具有調節細胞耗氧量以及下調胞外調控激酶(ERK-1/2)磷酸化的作用〔5〕。然而，SQSTM1在胰腺癌肺轉移過程中的詳細機制，以及這個基因在其他腫瘤轉移中是否也起到相同的關鍵作用，需要進一步的研究。

1 Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics〔J〕.CA Cancer JClin，2009;59:225-49.

2 Hezel AF，Kimmelman AC，Stanger BZ，et al.Genetics and biology of pancreatic ductal adenocarcinoma〔J〕.Genes Dev，2006;20:1218-49.

3 Jones S.Core signaling pathways in human pancreatic cancers revealed by global genomic analyses〔J〕.Science，2008;321(5897):1801-6.

4 Martin P，Diaz-Meco MT，Moscat J.The signaling adapter p62 is an important mediator of T helper 2 cell function and allergic airway inflammation〔J〕.EMBO J，2006;25:3524-33.

5 Rodriguez A，Duran A，Selloum M，et al.Mature-onset obesity and insulin resistance in mice deficient in the signaling adapter p62〔J〕.Cell Metab，2006;3:211-22.

6 Geetha T，Jiang J，Wooten MW.Lysine63 polyubiquitination of the nerve growth factor receptor TrkA directs internalization and signaling〔J〕.Mol Cell，2005;20:301-12.

7 Duran A，Linares JF，Galvez AS，et al.The signaling adaptor p62 is an important NF-kappaB mediator in tumorigenesis〔J〕.Cancer Cell，2008;13:343-54.