凋亡相關基因Survivin在非小細胞肺癌中的表達及意義

張曉燕 蔣軍廣 翟展藝 鄭元元 劉瑞芬 張婧雯 楊 超 孫 曼

(鄭州大學第一附屬醫院 河南省呼吸疾病研究所 河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室，河南 鄭州 450052)

肺癌是當前發病率和死亡率極高的惡性腫瘤之一，在老年人群中高發。多項研究表明肺癌的發生不僅與原癌基因的激活、抑癌基因的失活導致細胞增生過度和分化異常有關，還與細胞凋亡異常有關。生存蛋白(Survivin)是凋亡抑制基因，在肺癌的發生、發展中可能發揮重要作用。本實驗探討Survivin的臨床生物學意義及在非小細胞性肺癌(NSCLC)的發病機制中的作用，以期為NSCLC的早期診斷、治療和預后評估提供實驗依據。

1 對象與方法

1.1 一般資料 2008年1月至2009年11月在我院胸外科手術切除且病理證實為NSCLC的肺癌組織標本60例，男35例，女25例，年齡30～78〔平均(54±22.5)〕歲。鱗癌22例，腺癌38例，按組織學分級:高分化10例、中分化30例、低分化20例;按照2002年美國聯合癌癥分類委員會和國際抗癌聯盟制定的TNM分期標準:Ⅰ期17例、Ⅱ期19例、Ⅲ期18例、Ⅳ期6例;伴淋巴結轉移27例，不伴淋巴結轉移33例;病理學或影像學檢查有胸膜轉移26例，無轉移34例。所有入選的肺癌病人術前均未接受任何抗腫瘤治療。取20例NSCLC癌旁正常肺組織(距腫瘤邊緣大于3 cm并經病理切片證實為正常的肺組織)作為對照。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 末端轉移酶標記技術(TUNEL)凋亡試劑盒購于美國Promega公司，植物過氧化物酶(POD)轉換劑購自美國羅氏公司，兔抗人Survivin單克隆抗體、生物素-鏈霉親合素復合物(S-P)免疫組化試劑盒及二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2.2 免疫組化染色 采用S-P法，主要步驟:石蠟切片脫蠟水化，于檸檬酸緩沖液中行微波抗原修復，雙氧水阻斷內源性過氧化物酶活性，非免疫性動物血清封閉山羊血清阻斷非特異性反應，滴加一抗兔抗人Survivin單克隆抗體，滴加生物素標記的二抗，滴加S-P制劑，DAB顯色后自來水充分沖洗，蘇木素復染，稀鹽酸分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.2.3 細胞凋亡的檢測 采用TUNEL法，主要步驟:石蠟切片脫蠟水化，4%多聚甲醛固定，1∶500蛋白酶K工作液通透組織切片，4%多聚甲醛后固定，緩沖液平衡切片，加入孵育緩沖液標記DNA斷裂鏈，載玻片浸入2倍檸檬酸緩沖液(SSC)終止反應，熒光顯微鏡下分析樣品，加入POD轉換劑轉換，DAB顯色后自來水充分沖洗，蘇木素復染，稀鹽酸分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.2.4 Survivin陽性結果判定及凋亡指數(AI)的計算 在200倍視野下，隨機選取5個有陽性細胞存在的視野進行計數，每個視野計數100個細胞，共500個細胞。Survivin以胞質/胞核內出現棕黃色顆粒為陽性細胞。判定方法:(1)按陽性細胞所占百分數評分:0分:0%，1分:＜10%，2分:10% ～50%，3分:＞50%。(2)按細胞染色深淺評分:無棕黃色顆粒，與背景無區別為0分;有棕黃色顆粒，明顯高于背景底色為1分;有染色較清晰的棕黃色顆粒，介于強弱之間為2分;有大量的深棕色顆粒，染色強為3分。綜合染色強度和陽性細胞所占百分數進行判定，即(1)+(2):最后得分≥4分為陽性表達(+)，＜4分為陰性表達(-)。在40×10高倍視野下隨機選取10個視野觀察，計算凋亡細胞與所計數細胞總數的比值，即AI=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.3 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行分析，數據資料以x±s表示，采用χ2檢驗的連續性校正及直線相關分析。

2 結果

2.1 Survivin在NSCLC中的表達及與臨床病理特征的關系Survivin主要定位于胞質或胞核。60例NSCLC組織中Survivin的陽性表達率為46.7%(28/60)，20例正常肺組織的陽性表達率為10.0%(2/20)，兩者比較差異有統計學意義(χ2=8.604，P=0.003)。Survivin在NSCLC患者高分化組中的陽性表達率低于中、低分化組，Survivin在臨床分期Ⅰ和Ⅱ期的陽性表達率低于Ⅲ和Ⅳ期，有淋巴結轉移的NSCLC患者中的陽性表達率高于無淋巴結轉移者;而與NSCLC患者的年齡、性別、腫瘤直徑、病理分型、是否吸煙及有無胸膜轉移無關。見表1。

2.2 Survivin與細胞凋亡之間的關系 Survivin分值0分、1～2分、3～4分、5～6分者 AI分別為4.49±1.60，3.78±1.53，2.58±0.88，1.45±0.46。可見，Survivin積分與 AI呈負相關(r=-0.736，P=0.000)。

表1 Survivin在NSCLC組織中的表達及其與臨床病理特征的關系〔n(%)〕

3 討論

Survivin是凋亡抑制蛋白家族(IAP)中的成員，在胚胎、胎兒組織中顯著表達在終末分化的成人組織如肝、肺、腦、脾、胰、腎、心臟、外周血白細胞、淋巴結及骨骼肌中則不表達(胸腺和生殖腺除外)〔1〕。隨著對該基因更深入的研究，人們發現在人類多種腫瘤細胞中有Survivin的表達。Survivin抗凋亡的機制有以下幾種觀點:(1)通過直接抑制終末效應蛋白半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)和caspase-7，抑制caspase的活化和凋亡，從而抑制細胞凋亡〔2〕。(2)與輔助性線粒體源性caspase線粒體激活因子(SMAC)結合，進而對抗甚至抑制caspase活性;同時，還可保護IAP的其他成員，如X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)免受SMAC的抑制而維持抗凋亡功能〔3〕。(3)間接作用于細胞周期依賴激酶4(CDK4)，形成Survivin/CDK4復合物，引起p21的釋放，p21作用于 caspase-3前體，形成 procaspase-3/p21復合物，該復合物抑制了procaspase-3的激活，進而抑制了細胞的凋亡〔4〕。(4)與有絲分裂初期紡錘體的微管結合，間接抑制凋亡效應因子caspase對紡錘體的水解，抑制細胞凋亡〔5〕。(5)通過非caspase依賴的細胞凋亡途徑實現，如參與調節p53依賴的凋亡〔6〕。本實驗結果顯示，Survivin在胞質、胞核著色或胞質/胞核同時著色，偶見胞膜著色。在NSCLC中的表達明顯高于正常肺組織，提示Survivin的異常表達在NSCLC的發生、發展中起到一定作用。Survivin有可能成為一種腫瘤標記物，為肺癌的早期診斷提供實驗依據。

劉江偉等〔7〕報道，在胰腺癌中Survivin的陽性表達與病理學分級相關。Lu等〔8〕研究發現Survivin的表達與胃癌的分化程度有關。本實驗提示Survivin的表達有更高的惡性生物學意義，檢測Survivin有助于NSCLC惡性程度的判斷，Survivin陽性表達率越高，NSCLC惡性程度越高。Survivin在NSCLC臨床分期Ⅰ和Ⅱ期的陽性表達率低于Ⅲ和Ⅳ期，與劉紅菊等〔9〕報道的結果一致，檢測Survivin可能有助于臨床TNM分期。TNM分期作為一種臨床分期的標準，對腫瘤預后的判斷有相當重要的價值，TNM分期愈晚，預示著腫瘤侵襲性愈高和預后不良，因此檢測Survivin可能有助于NSCLC預后的判斷。本研究發現Survivin在NSCLC組織中的表達與有無淋巴結轉移有關，與張曉宇等〔10〕的研究一致。因此，檢測Survivin的表達可能有助于有無淋巴結轉移的判斷。

本實驗表明Survivin積分與AI呈負相關。因此可以推論，Survivin在組織中的高表達抑制了突變的、多余的細胞發生凋亡，促進了腫瘤的生長。但Survivin能否成為診斷NSCLC的腫瘤標記物及判斷預后的有效指標，還有待于更多的研究證實。

1 鮑曉蕾.凋亡相關基因PDCD5、Survivin在胃癌組織的表達及臨床意義〔D〕.吉林大學碩士學位論文，2007.

2 Ambrosini G，Adida C，Alteri DC.A novel anti-apoptosis gene，surviving，expressed in cancer and lymphoma〔J〕.Nature Med，1997;3(8):917-21.

3 Verhagen AM，Ekort PG，Pakusch M，et al.Identification of DIABLO，a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins〔J〕.Cell，2002;102(1):43-53.

4 Suzuki A，Ito T，Kawano H，et al.Survivin initiates procaspase 3/p21 complex formation as a result of interaction with CDK4 to resist Fas-mediated cell death〔J〕.Oncogene，2000;19(10):1346-53.

5 Deveraux QL，Takahashi R，Salvesen GS，et al.X-linked IAP is a direct inhibitor of cell death proteases〔J〕.Nature，1997;388(6639):300-4.

6 Mirza A，McGuirk M，Hockenberry TN，et al.Human survivin is negatively regulated by wild-type p53 and participates in p53-dependent apoptotic pathway〔J〕.Oncogene，2002;21(17):2613-22.

7 劉江偉，李開宗，竇科峰.Survivin在胰腺癌組織中的表達及其與p53的相關性研究〔J〕.西北國防醫學雜志，2003;24(6):417-9.

8 Lu CD，Altieri DC，Tanigawa N.Expression of a novel antiapoptosis gene，survivin，correlated with tumour cell apoptosis and p53 accumulation in gastric carcinomas〔J〕.Cancer Res，1998;58(9):1808-12.

9 劉紅菊，陶曉南，白 明，等.凋亡抑制基因survivin、bcl-2、bax在肺癌中表達的研究〔J〕.中國實用內科雜志，2007;27(10):767-9.

10 張曉宇，鐘立厚，胡 克，等.生存素在非小細胞肺癌中的表達及與細胞凋亡的關系〔J〕.中國肺癌雜志，2004;7(2):138-41.