Ang-2、COX-2及CD105聯(lián)合檢測(cè)評(píng)價(jià)食管鱗癌患者預(yù)后的意義

白美玲 張林西 李海軍 郝秀輕

(河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，河北 張家口 075000)

我國(guó)是世界上食管癌的高發(fā)國(guó)家之一，部分患者早期癥狀不典型，就診時(shí)多為中晚期，血行播散是導(dǎo)致食管癌患者最終死亡的重要因素。近年來(lái)腫瘤抗血管生成治療得到廣泛關(guān)注，但腫瘤血管生成的機(jī)制尚不明確。本研究采用S-P免疫組化方法檢測(cè)97例食管鱗癌組織中血管生成素-2(Ang-2)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)及CD105抗體標(biāo)記的微血管密度(MVD)來(lái)闡述腫瘤血管生成機(jī)制，同時(shí)結(jié)合隨訪資料判斷三者的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，以便尋求新的生物治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 臨床病理資料 收集河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院1997年1月至2000年12月住院患者中臨床病理資料齊全的食管鱗

狀細(xì)胞癌97例，男85例，女12例;年齡42～79歲，平均60歲;癌組織侵及食管黏膜及黏膜下層18例，侵及肌層40例，侵及漿膜或漿膜外39例;無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例;根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期:Ⅰ期18例，Ⅱ期43例，Ⅲ期30例，Ⅳ期6例;高分化鱗癌28例，中分化鱗癌46例，低分化鱗癌23例。另選取12例切緣正常食管組織作為對(duì)照。97例患者全部通過(guò)信件及電話溝通隨訪，隨訪截止日期2011年1月1日，共12例死亡，隨訪時(shí)間為3～120個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為53個(gè)月，失訪6例。

1.2 免疫組織化學(xué)試劑及步驟 兔抗人Ang-2多克隆抗體(克隆號(hào)BA1530，工作濃度1∶100)為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品;兔抗人COX-2單克隆抗體(克隆號(hào)ZA-0515，即用型)、鼠抗人CD105單克隆抗體(克隆號(hào)ZM-0297，即用型)SP試劑盒和DAB顯色劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。采用SP法進(jìn)行常規(guī)免疫組化染色，具體步驟按試劑盒說(shuō)明書操作，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照片由試劑公司提供。采用雙盲法，由兩位資深病理醫(yī)師對(duì)切片進(jìn)行閱片及診斷，Ang-2與COX-2均以腫瘤細(xì)胞胞漿出現(xiàn)淺黃色到深棕色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，以綜合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 MVD計(jì)數(shù) CD105標(biāo)記MVD，其陽(yáng)性以血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕色或棕黃色染色為標(biāo)準(zhǔn)。在低倍鏡下(200倍)尋找整張切片中富含血管組織的“熱點(diǎn)”區(qū)，即棕黃染色密度最高的區(qū)域，該區(qū)域必須要位于癌組織內(nèi)部或與癌組織相連。然后在高倍鏡下(400倍)計(jì)數(shù)其中的血管數(shù)目。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。各指標(biāo)表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間作直線回歸相關(guān)分析，對(duì)有預(yù)后價(jià)值的指標(biāo)作Kaplan-Meier生存曲線，組間差異比較用Log-rank檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Ang-2和COX-2在切緣正常組織與癌組織的表達(dá)情況Ang-2和COX-2陽(yáng)性均定位于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，食管鱗癌組織Ang-2表達(dá)陽(yáng)性率為69.07%(67/97)顯著高于癌旁正常組織Ang-2表達(dá)陽(yáng)性率〔33.33%(4/12)，P＜0.05〕;食管鱗癌組織COX-2表達(dá)陽(yáng)性率為77.32%(75/97)顯著高于切緣正常組織〔41.67%(5/12)，P ＜0.05〕。

2.2 Ang-2和COX-2的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 食管鱗癌組織中Ang-2的陽(yáng)性表達(dá)和癌組織浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)(P＜0.05)，即隨著癌細(xì)胞浸潤(rùn)越深、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期越晚時(shí)Ang-2表達(dá)會(huì)增高。而COX-2的表達(dá)水平與癌組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)(P＜0.05)，即隨著分化程度越低、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期越晚時(shí)COX-2表達(dá)率升高。見表1。

2.3 Ang-2與COX-2的關(guān)系 在食管鱗癌中Ang-2和COX-2表達(dá)變化的趨勢(shì)一致:兩者表達(dá)均上調(diào)(r=0.39，P=0.028)。

2.4 Ang-2和COX-2與MVD的關(guān)系 CD105標(biāo)記的MVD在67例Ang-2陽(yáng)性表達(dá)食管鱗癌組織中表達(dá)為53例，MVD計(jì)數(shù)為22.17±3.07;CD105標(biāo)記的MVD在23例Ang-2陰性表達(dá)食管鱗癌組織中表達(dá)為21例，MVD計(jì)數(shù)為28.41±3.60，Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果，Ang-2表達(dá)與MVD呈正相關(guān)(r=0.795 4，P＜0.05)。CD105標(biāo)記的 MVD在75例COX-2陽(yáng)性表達(dá)食管鱗癌組織中表達(dá)為43例，MVD計(jì)數(shù)為20.12±2.02，CD105標(biāo)記的MVD在22例COX-2陰性表達(dá)食管鱗癌組織中陽(yáng)性表達(dá)僅為7例，MVD計(jì)數(shù)為26.61±3.51，Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果，COX-2表達(dá)與 MVD呈正相關(guān)(r=0.853 8，P＜0.05)。

表1 Ang-2和COX-2陽(yáng)性表達(dá)與食管鱗癌各臨床病理參數(shù)間的關(guān)系〔n(%)〕

2.5 Ang-2和COX-2的表達(dá)與患者術(shù)后生存率的關(guān)系 通過(guò)對(duì)食管癌患者隨訪資料的分析可以看出，Ang-2表達(dá)陽(yáng)性的患者10年生存率(12%)明顯低于Ang-2陰性患者生存率(26%)。另經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，COX-2陽(yáng)性表達(dá)的食管癌患者10年生存率(10%)顯著低于COX-2陰性患者的生存率(31%)。

3 討論

促血管生成因子中以Ang-2的作用最強(qiáng);COX-2的高表達(dá)則可促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，是調(diào)控腫瘤血管形成的重要因素之一;而腫瘤內(nèi)MVD最能代表血管新生強(qiáng)度。故同時(shí)檢測(cè)這三種生物學(xué)指標(biāo)對(duì)于評(píng)定食管癌惡性程度、制定個(gè)體化的治療方案及評(píng)估預(yù)后具有重要意義。

已有研究表明，Ang-2在誘導(dǎo)多種腫瘤血管形成中起著重要的作用，且隨著 Ang-2表達(dá)的上調(diào)，患者的預(yù)后越差〔1～3〕。我們的前期研究中也已發(fā)現(xiàn)Ang-2在誘導(dǎo)腫瘤血管形成中起著重要的作用〔4〕，而在本研究中也看到了Ang-2在食管鱗癌組織中高表達(dá)同時(shí)伴有微血管密度增高、成熟度下降，患者臨床TNM分期晚，術(shù)后生存率低。這表明Ang-2不僅在誘導(dǎo)食管癌血管形成中起著重要的作用，而且其的高表達(dá)可作為評(píng)價(jià)食管癌患者預(yù)后的一項(xiàng)獨(dú)立的指標(biāo)。

COX-2在細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生中起一定作用。COX-2在正常組織中幾乎不表達(dá)，但是在特殊因子刺激下可高表達(dá)于多種腫瘤組織中，并具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)新生血管形成、調(diào)節(jié)腫瘤免疫等多方面的功能〔5〕，其中促進(jìn)腫瘤血管生成的作用近年來(lái)倍受學(xué)者重視。本研究提示COX-2在食管癌中的表達(dá)不僅增加腫瘤組織的侵襲力，而且誘導(dǎo)宿主微血管形成，為其快速生長(zhǎng)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供條件。

Takatori等〔6〕研究認(rèn)為新輔助放化療后COX-2的表達(dá)水平與食管癌復(fù)發(fā)率顯著相關(guān)，可作為食管癌預(yù)后因子。而在我們的隨訪資料中也看到，隨著COX-2陽(yáng)性表達(dá)率的上升，患者的生存率下降，這進(jìn)一步表明COX-2的表達(dá)可作為食管癌患者一項(xiàng)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，因此該指標(biāo)的檢測(cè)對(duì)食管癌患者術(shù)后臨床用藥的指導(dǎo)和預(yù)后的判斷尤其重要。國(guó)外有報(bào)道〔7〕，COX-2可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)Ang-2及其受體的產(chǎn)生，從而促進(jìn)腫瘤血管生成。本次研究結(jié)果表明COX-2與Ang-2在食管癌表達(dá)異常增高，且兩者均呈陽(yáng)性表達(dá)的區(qū)域較單一陽(yáng)性表達(dá)的區(qū)域血管密集，可能機(jī)制為COX-2間接上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞Ang-2的表達(dá)或促進(jìn)食管癌細(xì)胞誘導(dǎo)Ang-2的生成來(lái)增加食管癌血管的生成，但是具體作用機(jī)制還不太明確，仍需要進(jìn)一步研究證實(shí)?？傊?，兩者在腫瘤的形成、浸潤(rùn)、擴(kuò)散等過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用，可以作為判斷食管癌生物學(xué)行為和預(yù)后的重要指標(biāo)。

1 Gelareh Z，Keyvan K，Qian B，et al.Role of angiopoietin-2 in regulating growth and vascularity of astrocytomas〔J〕.JOncol，2010;2(1):1-7.

2 Jo MJ，Lee JH，Nam BH.Preoperative serum angiopoietin-2 levels correlate with lymph node status in patients with early gastric cancer〔J〕.Ann Surg Oncol，2009;16(7):2052-7.

3 Sallinen H，Heikura T，Laidinen S，et al.Preoperative angiopoietin-2 serum levels:a marker of malignant potential in ovarian neoplasms and poor prognosis in epithelial ovarian cancer〔J〕.Int JGynecol Cancer，2010;20(9):1498-505.

4 白美玲，張 凡，張林西，等.Ang-2和Tie-2在食管鱗癌患者腫瘤組織中的表達(dá)及意義〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010;30(15):2226-7.

5 Ozuysal S，Bilgin T，Ozgur T.Expression of cyclooxygenase-2 in ovarian serous carcinoma:correlation with angiogenesis，nm23 expression and survival〔J〕.Eur J Gynaecol Oncol，2009;30(6):640-5.

6 Takatori H，Natsugoe S，Okumura H，et al.Cyclooxygenase-2 expression is related to prognosis in patients with esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Eur J Surg Oncol，2008;34(4):397-402.

7 Coffelt SB，Tal AO，Scholz A.Angiopoietin-2 regulates gene expression in tie-2-expressing monocytes and augments their inherent proangiogenic functions〔J〕.Cancer Res，2010;70(13):5270-80.