疲勞應激對血管內皮功能障礙大鼠脂蛋白相關磷脂酶A2含量和4型G蛋白耦聯受體表達的影響及通絡干預的作用

韓建科 魏 聰 賈振華 常麗萍 王宏濤 張彥芬

(河北以嶺醫藥研究院，河北 石家莊 050035)

長期的過度疲勞得不到有效緩解會對人體多個系統造成損害，尤其對血管系統的危害更大，可引起血管內皮損傷，導致動脈粥樣硬化及冠脈狹窄，引發嚴重的心血管事件。研究表明，脂蛋白相關磷脂酶A2(lp-PLA2)水解氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)磷脂成分生成的溶血性磷脂酰膽堿(LPC)是導致血管內皮功能障礙的重要因子〔1〕。LPC發揮損傷內皮細胞的作用也需要特異性受體作用，其中包括最新發現的4型G蛋白耦聯受體(GPR4)。最近研究表明，LPC通過內源性GPR4介導內皮細胞功能障礙性異常。既往研究發現過度疲勞可導致血管內皮損傷，而對過度疲勞模型大鼠Lp-PLA2激活損傷血管內皮機制未見報道。本實驗將研究過度疲勞致血管內皮功能障礙大鼠血清lp-PLA2和GPR4的表達變化及通絡干預的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級健康雄性 Wistar大鼠60只，體重220～250 g，由北京維通利華動物中心提供〔許可證號:SCXK(京):2006-2009〕。大鼠籠養，5只/籠，飼養于國家中醫藥管理局重點研究室(心腦血管絡病)實驗中心，光照12 h/d，溫度20℃ ～23℃，相對濕度40% ～60%。

1.2 藥物 人參總皂苷(批號:20090116)和通心絡超微粉(批號:20090228):石家莊以嶺藥業股份有限公司提供。人參用量:生藥1.2 g·kg-1·d-1(1 mg干粉約為0.117 g生藥)，通心絡用量:1 g干粉約為1.46 g生粉(生藥1.2 g·kg-1·d-1)。

1.3 試劑 內皮素(ET)放射免疫試劑盒(北京普爾偉業生物科技有限公司，批號:20091025);一氧化氮(NO)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號:20091106);lp-PLA2試劑盒(上海藍基生物科技有限公司，批號:E02L0205);GPR4多克隆抗體(美國Abcam公司，批號:ab75330)。ECL化學發光試劑盒、蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)。RNA提取試劑Trizol Reagent(Invitrogen公司);逆轉錄酶(M-MLV)，核糖核酸酶抑制劑(RNasin)，dNTP，Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase)，隨機引物(Random primers)，瓊脂糖(agarose)均為美國Promega公司產品;β-actin(Santa Cruz公司)。

1.4 儀器設備 大鼠泳缸〔國家中醫藥管理局重點研究室(心腦血管絡病)實驗中心制作〕;S-3500型掃描電鏡(日本日立公司);ABI 7300 Real-Time PCR System(美國 ABI公司);UVP凝膠掃描系統(美國UVP公司);電轉膜儀、半干轉膜儀、垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司);酶標儀(美國Thermo公司)。

1.5 方法

1.5.1 分組及給藥 將大鼠隨機分為:①對照組。②疲勞應激組:參照文獻〔2〕并進行改良，以“基礎飲食+負重力竭游泳法”建立過度疲勞動物模型，造模大鼠于基礎飲食(每只成年大鼠于靜息狀態下的進食量，約相當于自身體重的5%)狀態下在25℃ ～27℃水溫的自制泳缸(60 cm×40 cm×100 cm)中，每日強迫負重(尾部懸掛自身體重5%的重物)游泳兩次，前后相差10 min，每次游泳至力竭為止，如見大鼠游泳范圍逐漸縮小，動作明顯失調，頭部沒入水面下10 s不能上浮則終止游泳。連續力竭游泳14 d至模型建立。③人參組(生藥1.2 g·kg-1·d-1);④通心絡組(生藥1.2 g·kg-1·d-1)。

1.5.2 標本采集與指標檢測

1.5.2.1 過度疲勞模型評價 實驗末測體重。爬桿時間:于末次給藥后，將單只大鼠放在懸桿架的玻璃棒上，使其肌肉處于靜力緊張狀態，記錄大鼠由于肌肉疲勞從玻璃棒跌落的時間，第三次跌落時終止實驗，累計計量三次跌落時間為爬桿時間。最后一次力竭游泳時間。

1.5.2.2 血液指標 10%水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔麻醉大鼠后，腹主動脈采血，一份注入含有10%乙二胺四乙酸(EDTA)二鈉 30μl和抑肽酶 40μl的試管中，混勻，4℃，3 000 r/min，離心10 min;另留二份常規分離血清后，-20℃保存。采用放射免疫分析法檢測ET，硝酸還原酶法檢測NO，酶聯免疫吸附方法檢測lp-PLA2，實驗操作嚴格按照說明書進行。

1.5.2.3 掃描電鏡觀察 造模結束后10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仔細分離并截取約1.5 mm×1.5 mm×1.5 mm大小主動脈標本迅速投入2.5%戊二醛中4℃固定，PBS充分清洗后，用1%鋨酸4℃固定再用PBS充分清洗，酒精梯度脫水，臨界點干燥器對樣品進行干燥，真空鍍膜儀對樣品進行金屬鍍膜，掃描電鏡觀察并攝片。

1.5.3 Real Time PCR法檢測GPR4 mRNA表達 取約100 mg血管組織，Trizol一步法提取組織總RNA，42℃反轉錄50 min合成第一鏈cDNA，采用染料法(Syber Green I)進行實時熒光定量PCR檢測。擴增完畢后，進入SDSv1.3軟件結果分析界面，以GAPDH為內參照基因，與對照組相比，得到各組目的基因表達的定量值(RQ值)，將RQ值用于統計分析。GPR4(115 bp)所用引物序列:上游5'-CGGGTCAAGACAGCAGTAG-3'，下游5'-AGAAGGTGTGGTTGTAGCGAT-3'。

1.5.4 Western印跡法檢測GPR4蛋白表達 各組實驗結束后留取主動脈組織，用PBS洗去組織表面殘留血液，取100 mg主動脈組織標本，加入組織裂解液下勻漿，4℃離心分離上清，采用改良酚試劑法進行蛋白定量。取各組蛋白樣品進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉膜后封閉，經一抗結合后洗膜，二抗結合，洗膜后采用增強型ECL化學發光法顯色。凝膠成像系統照相，實驗結果采用quantity one軟件分析，掃描光密度(OD)值，蛋白相對表達量以目的蛋白與內參β-actin的比值表示。

1.6 統計學處理 數據用x±s表示。采用SPSS13.0統計軟件包，多個樣本均數比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，多個樣本均數間的兩兩比較用最小顯著差法(LSD)，若方差不齊則采用Satterthwaite-t檢驗行兩兩比較。

2 結果

2.1 各組大鼠體重、爬桿時間、游泳時間變化 與對照組比較，實驗末疲勞應激組大鼠體重和爬桿時間均顯著下降(均P＜0.01);與模型組比較，人參和通心絡干預對體重無明顯影響，但均可以明顯延長大鼠爬桿時間(P＜0.05，P＜0.01);比較各組最后一次力竭游泳時間，人參和通心絡均有延長大鼠力竭游泳時間的作用(P＜0.05)。見表1。

表1 實驗末各組大鼠體重、爬桿時間、最后一次力竭游泳時間變化(x ± s，n=15)

2.2 掃描電鏡下動脈內皮形態變化 對照組血管內皮表面光滑，內皮細胞連接緊密，排列規整;疲勞應激組內皮細胞界限消失，細胞脫落，表面有紅細胞等沉積物;人參組和通心絡組內皮細胞表面光滑，界限清晰，連接較緊密，無剝脫損傷。見圖1。

2.3 各組大鼠血液NO、ET、lp-PLA2水平 與對照組比較，疲勞應激組大鼠血清NO水平明顯降低(P＜0.05)，血漿ET水平顯著升高(P＜0.01)，血清lp-PLA2水平顯著升高(P＜0.01);與疲勞應激組比較，人參組、通心絡組大鼠血清NO水平均顯著升高(均P＜0.05)，血漿ET水平顯著降低(P＜0.05，P＜0.01);血清lp-PLA2水平顯著降低(均P＜0.01)。見表2。

表2 各組大鼠血液ET、NO、lp-PLA2水平(x ± s，n=15)

2.4 RT-PCR檢測GPR4 mRNA表達 疲勞應激組大鼠血管組織GPR4 mRNA表達(4.34±0.52)較正常組(0.81±0.18)顯著上調(P＜0.01)。而人參和通心絡均能夠明顯下調GPR4 mRNA的表達(2.32±0.32，1.49±0.30)，且均有統計學差異(P ＜0.01)。

2.5 Western印跡檢測GPR4蛋白表達 與對照組比較，疲勞應激組GPR4蛋白表達顯著上調;與過勞組比較，人參和通心絡干預組GPR4蛋白表達均明顯下調，且通心絡下調更加明顯。見圖2。

圖1 各組大鼠主動脈內皮細胞掃描電鏡(×1 500)

圖2 各組主動脈GPR4蛋白表達變化

3 討論

由于近些年來“過勞死”現象日趨增多，而且有向年輕化發展的趨勢，對于過勞等社會心理因素在心腦血管疾病發生中的作用應引起重視。既往研究發現，負重力竭游泳可導致血管內皮形態和結構變化及功能障礙，如內皮細胞腫脹、炎細胞浸、內皮分泌NO減少、ET增加〔3〕。長期過度疲勞導致的慢性應激促使體內自由基產生增多，氧化應激是內皮損傷過程中的重要因素。病理情況下，超氧陰離子等自由基促使過多的LDL氧化生成ox-LDL。ox-LDL與內皮功能障礙關系密切，是血管損傷過程中的重要起始因子〔4〕。

研究證明，lp-PLA2水解ox-LDL上的氧化卵磷脂產生LPC和氧化的非酯化游離脂肪酸等促炎物質起到促動脈硬化作用〔5〕，LPC在lp-PLA2影響內皮功能障礙中發揮重要作用，lp-PLA2在早期冠狀動脈粥樣硬化病變中的作用主要通過LPC產生〔1〕。LPC可以通過與細胞膜上的特定受體相互作用發揮生物學效應，如孤兒G蛋白耦聯受體(G2A)、GPR4等，其中GPR4受體分布廣泛，在血管內皮細胞中有一定表達〔6〕。最近研究表明，LPC通過內源性GPR4受體介導內皮細胞障礙性功能異常，通過RNA干擾GPR4受體，可以部分抑制LPC誘導的應力纖維形成、RhoA激酶激活以及內皮細胞的通透性，GPR4受體可能在LPC觸發的炎癥反應中具有重要作用〔7〕。

研究證明通心絡可以消除自由基損傷，起到抗氧化、改善內皮功能的作用。人參作為通心絡拆方研究的代表藥，針對絡氣虛滯具有益氣通絡的作用。研究顯示，人參對高同型半胱氨酸血癥所致的內皮損傷有防治作用，可以改善內皮依賴性血管舒張功能。人參還具有抗中樞疲勞，抗自由基，調節糖代謝等抗疲勞作用〔8〕。本研究對過度疲勞引起的血管內皮損傷大鼠血清lp-PLA2和主動脈GPR4受體表達進行檢測，發現過度疲勞模型大鼠血清lp-PLA2水平增加，主動脈GPR4 mRNA和蛋白表達均顯著增加。通絡干預對血清lp-PLA2水平和主動脈GPR4表達均有顯著抑制作用。這可能是通絡方藥阻止和減緩血管內皮損傷的重要機制之一。因此，對于心腦血管疾病的防治，除倡導科學的工作與生活態度、健康的生活方式外，對于已經因過勞等不良社會心理因素誘發血管內皮功能損傷者，通絡治療是防治此類疾病發生發展的重要手段之一。

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6 Kim KS，Ren J，Jiang Y，et al.GPR4 plays a critical role in endothelial cell function and mediates the effects of sphingosylphosphorylcholine〔J〕.FASEB J，2005;19(7):819-21.

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