反義miRNA-21/rAV-Tumstatin腺病毒載體對膀胱癌細胞生長的抑制作用

溫都蘇 劉祿成 魏 巍 李 志 郭 航 張 明

(吉林大學第二醫院泌尿外科，吉林 長春 130041)

癌基因與抑癌基因的平衡紊亂在腫瘤的生長和轉移中扮演著重要角色〔1，2〕。微小 RNA-21(miRNA-21)是目前公認的癌基因〔3，4〕，腫瘤抑素(Tumstatin)則是被廣泛認同的抑癌基因〔5〕。已有研究證實，前者在膀胱癌病人的腫瘤組織中表達上調，后者則表達不足。由此推測，這兩種基因的平衡失調在膀胱癌的發生發展中可能起著至關重要的作用。本研究應用反義miRNA-21/rAV-Tumstatin腺病毒載體，通過經尿道膀胱灌注的方法治療，觀察該載體對裸鼠膀胱原位移植癌生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 反義miRNA-21/rAV-Tumstatin腺病毒載體由本實驗室構建〔6，7〕。人膀胱癌T24細胞株購自中國科學院上海細胞所。二苯基溴化四氮唑藍(MTT)比色儀為美國Sigma公司產品。原位末端標記(TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒購自北京中山生物公司。BALB/C裸鼠購于中國醫學科學院中國協和醫科大學實驗動物研究所。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠膀胱癌模型的建立和療效評估及腫瘤標本的處理按照參考文獻〔6〕所述方法建立模型。選取20只瘤體大小幾乎相同的成瘤裸鼠，隨機分為四組，每組5只，分別每隔5 d經尿道膀胱灌注1次載體(反義miRNA-21、rAV-Tumstatin、聯合應用組)和生理鹽水(對照組)，每組均灌注4次，28 d為1個療程。每隔7 d(灌注后的第2天)用ESDREF1.5T核磁掃描儀檢測腫瘤大小，計算腫瘤體積。在實驗結束后的第2天處死所有裸鼠，迅速切開膀胱，完整剝取瘤體稱重，并用游標卡尺檢測腫瘤的長徑和短徑，以長(mm)×寬(mm)表示腫瘤的大小，然后切片，10%甲醛固定，石蠟包埋備用。

1.2.2 MTT法檢測腫瘤細胞的增殖 5μm厚的組織切片脫蠟、脫水后經蛋白酶 K 37℃消化30 min，雙氧水封閉，滴加MMT顯色液，37℃濕盒孵育1 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后加過氧化物酶標記的抗地高辛抗體，37℃濕盒孵育30min，蘇木素復染。用PBS代替MTT顯色液作為陰性對照，陽性對照切片經DNA酶Ⅱ預處理10 min后按MTT法步驟進行染色，實驗重復3次。陽性結果判定:增殖細胞的胞質呈黃褐色。每張切片觀察5個視野，每個視野計數200個細胞，增殖細胞所占的百分率即為瘤細胞的增殖率。

1.2.3 TUNEL法檢測腫瘤細胞的凋亡 仍用1.2.2的處理標本，不同的是，把滴加的MTT顯色液換為TUNEL反應液進行孵育，以PBS代替TUNEL作為陰性對照。陽性對照切片經DNA酶Ⅰ處理后按TUNEL法染色步驟。結果判定:凋亡細胞的胞核呈棕黃色，凋亡細胞在計數的200個細胞中所占的百分率即為凋亡率。

1.3 統計學處理 應用SPSS16.0統計軟件進行分析，資料數據以x±s表示，均數間比較用t檢驗。

2 結果

2.1 反義miRNA-21/rAV-Tumstatin雙靶向治療對移植瘤生長的影響 反義miRNA-21組，rAV-Tumstatin組和聯合應用組的腫瘤體積分別從第14、21、28天開始逐漸變小，三個治療組間比較，差異均有統計學意義(均P＜0.05)，其中聯合應用組的抑瘤效果最為顯著，從第28天起該組裸鼠的腫瘤體積明顯小于rAV-Tumstatin組(P＜0.05)。實驗結束后測得各組的腫瘤大小依次是:反義 miRNA-21組(37.50±9.21)mm2，rAV-Tumstatin組(28.64±5.13)mm2，聯合用藥組(13.78±6.25)mm2，對照組(69.75±8.43)mm2。單一治療組與對照組比較雖差異具有統計學意義(P＜0.05)，但聯合用藥組和對照組比較差異更明顯(P＜0.01)。

2.2 反義miRNA-21/rAV-Tumstatin雙靶向治療對移植瘤組織中腫瘤細胞增殖的影響 反義miRNA-21組，rAV-Tumstatin組，聯合應用組和對照組的細胞增殖率分別為48.7%±6.2%，35.8% ±9.4%，27.8% ±3.7%和92.8% ±7.4%。與對照組比較，各治療組細胞均出現了不同程度的生長抑制現象(均P＜0.01)，其中聯合應用組的生長抑制最為明顯，與rAV-Tumstatin組比較，差異仍具有統計學意義(P＜0.05)。見圖1。

2.3 反義miRNA-21/rAV-Tumstatin雙靶向治療對移植瘤組織中腫瘤細胞凋亡的影響 TUNEL法檢測結果顯示，反義miRNA-21組，rAV-Tumstatin組，聯合應用組和對照組腫瘤細胞的凋亡率分別為51.2% ±7.5%，57.8% ±6.9%，79.3% ±4.1%和8.3%±2.6%。三個治療組的凋亡率均比對照組明顯增加(均P＜0.01)，其中聯合應用組細胞的凋亡率最高，與單一治療的兩組比較，差異仍具有統計學意義(P＜0.05)。見圖2。

圖1 裸鼠移植瘤細胞增殖分析(MTT，×200)

圖2 裸鼠移植瘤細胞凋亡分析(TUNEL，×200)

3 討論

新近研究認為，腫瘤是一個多因素和多基因共同參與的復雜疾病。由于聯合基因靶向治療腫瘤可針對不同的基因極大地提高腫瘤相關基因的治療效果，同時降低對其他正常組織器官的毒副作用，故成為目前腫瘤治療研究的熱點〔8，9〕。本實驗中，針對癌基因miRNA-21和抑癌基因Tumstatin分別構建了反義miRNA-21和rAV-Tumstatin腺病毒載體，結果發現二者單獨或聯合應用時，對裸鼠原位膀胱癌移植模型及癌細胞雖然均具有抑制增殖并誘導其凋亡的作用，但是聯合應用時作用更大，效果更佳。這一結果提示:靶向miRNA-21和Tumstatin均可分別抑制膀胱癌細胞的生長，但靶向雙位點由于在抑制癌基因表達的同時上調了抑癌基因水平，從兩個截然不同的層面雙重作用，具有更好的正性相加功效，從而使其抑制腫瘤的作用發揮到最大程度。本實驗結果為臨床膀胱癌的多位點基因治療提供了實驗依據，亦為今后的臨床試驗奠定了理論基礎，其臨床實際應用前景與潛力值得進一步深入研究。

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