Survivin基因沉默對結直腸癌PTTG mRNA的影響

史美龍

(吉林省人民醫院基本外科，吉林 長春 130021)

Survivin基因屬于凋亡抑制基因家族，Survivin蛋白在人結腸癌組織以及細胞株中均顯著高表達，與結直腸癌的發生發展、侵襲轉移及血管形成有關，已成為具有潛在價值的腫瘤生物學標志物和腫瘤治療的新靶點〔1，2〕。本課題前期構建了靶向干擾Survivin的小發卡RNA(shRNA)，并對Survivin基因沉默后結直腸癌的生物學行為進行了評價，發現其能夠明顯抑制結直腸癌細胞增殖〔3，4〕。在前期研究工作的基礎上，本研究利用已經構建成功的重組載體，探討Survivin基因沉默后垂體瘤轉化基因(PTTG)mRNA的表達，旨在為闡明Survivin在結腸癌發生發展中的作用及基因治療的應用方面提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 結直腸癌Lovo細胞株購自中國科學院上海細胞生物研究所。RPMI1640培養基購自Gibco公司，轉染試劑脂質體lipo2000購自Invitrogen公司，質粒小提試劑盒購自Promega公司。重組質粒pGenesil-2-對照(非同源干擾序列插入pGenesil-2)和pGenesil-2-Survivin 1(插入靶向Survivin基因5'-GGACCACCG CATCTCTACA-3'目的片段干擾序列的pGenesil-2干擾載體)以及pGenesil-2-Survivin 2(插入靶向Survivin基因5'-GGCTGGCTTCATCCACTGC-3'目的片段干擾序列的pGenesil-2干擾載體)由本實驗室構建。

1.2 質粒抽提 將本實驗構建的重組質粒pGenesil-2-對照、pGenesil-2-Survivin 1和pGenesil-2-Survivin 2接種于50 ml LB培養液中，37℃、250 r/min振搖培養16 h。運用質粒抽提試劑盒抽提質粒DNA，按照試劑盒說明書進行。

1.3 細胞轉染 運用含10%胎牛血清在37℃、5%CO2培養箱中培養Lovo細胞。將細胞接種于6孔板中，接種密度約為5×105個/孔。運用脂質體Lipo 2000轉染重組質粒pGenesil-2-對照、pGenesil-2-Survivin 1 和 pGenesil-2-Survivin 2，轉染方法按照Lipo2000說明書進行。

1.4 實時熒光定量PCR 于轉染后0、24、48和72 h收集細胞，運用Trizol法按照操作說明書提取總RNA(購自北京百泰克生物科技有限公司)，運用反轉錄試劑盒(購自Fermentas公司)逆轉錄為cDNA，-20℃保存。特異性引物用于實時熒光定量PCR檢測Survivin和PTTG的表達。Survivin引物:上游:5'-GCCAGATTTGAATCGCGGGA-3';下 游:5'-GCAGTGGATGAAGCCAGCCT-3'，產物片段長度為185 bp。PTTG引物:上游:5'-AGTTTCAACCACGTTTTGGC-3';下游:5'-CTTTTCAAGCT CTCTCTCCT-3'，產物片段長度為352 bp。管家基因GAPDH引物，上 游:5'-CCAATATGATTCCACCCATG-3';下 游:5'-GAGAAGGCTGGGG CTCATTT-3'，產物片段長度為195 bp，引物由上海英俊生物有限公司合成。

20μl反應體系中含 cDNA樣品2.0μl，SYBR Premix Ex TaqTM(2 ×)10.0 μl，上、下游引物(20 pmol/μl)各0.2 μl，去離子水補足20μl。Eppendorf實時熒光定量PCR儀上設置95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃延伸60 s，共40個循環。以GAPDH為內對照。將 cDNA 液按101、102、103和104、105梯度稀釋后，各取2μl進行實時熒光定量PCR反應，檢測目的基因和GAPDH的擴增效率，Ct值為熒光信號強度超過設置的閾值強度時所經歷的循環數。ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)。采用比較循環閾值法(2-ΔΔCt)分析樣本中Survivin和PTTG的相對含量〔5〕。具體計算方法如下:以加入Lipo2000轉染試劑組作為正常對照，分別將轉染重組質粒pGenesil-2-對照、pGenesil-2-Survivin 1和pGenesil-2-Survivin 2與正常對照組做比較，得倍數為 N(N=2-ΔΔCt)，其中 ΔΔCt= ΔCt(重組質粒)-ΔCt(正常對照)。

1.5 統計學處理 數據用x±s表示，采用SPSS19.0統計軟件包處理數據，各組之間的差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。

2 結果

2.1 實時熒光定量PCR標準曲線制作及Ct值測定 實時熒光定量PCR擴增目的基因和內參基因cDNA片段，熒光量的增長曲線符合標準的“S”形熒光增長曲線，3個復孔實時熒光值曲線擬合良好，指數增長期的起始點即循環閾值(Cycle threshold，Ct)接近，陰性對照Ct值趨于0;熔解曲線集中，峰值高尖平滑，表明實驗反應體系穩定，模板分配均勻，引物無二聚體形成，結果可靠。以不同起始濃度模板(分別為101、102、103、104、105)制作標準曲線，線性關系大于98%，擴增效率均大于95%，可以用2-ΔΔCt法對比Survivin和PTTG mRNA在不同組的表達差異。

2.2 Survivin和PTTG mRNA在不同組的表達 Lovo細胞轉染重組質粒pGenesil-2-對照、pGenesil-2-Survivin 1和pGenesil-2-Survivin2后，Survivin mRNA表達情況見表1，PTTG mRNA表達情況見表2。Survivin基因沉默后24～72 h，與正常對照組相比，Survivin mRNA表達明顯降低(P＜0.05)，表明干擾效果可以滿足實驗需要。Survivin基因沉默后24～72 h后，PTTG mRNA表達較相同時間點正常對照組均呈現下調趨勢，其中，24和48 h后，pGenesil-2-Survivin 1組和 pGenesil-2-Survivin 2組PTTG mRNA表達顯著低于正常對照組(P＜0.05)。

表1 各組轉染后不同時間Survivin mRNA表達情況(x ± s，n=6)

表2 各組轉染后不同時間PTTG mRNA表達情況(x ± s，n=6)

3 討論

Survivin是近年來發現的凋亡抑制蛋白家族新成員，是有絲分裂及程序性細胞死亡關鍵調節因子，其功能不僅局限于抑制細胞凋亡，而且能夠調節有絲分裂的紡錘體關卡，參與腫瘤血管形成及腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性。Survivin主要表達于黏膜層腺體底部，結腸癌組織及細胞株中顯著增高，而且與腫瘤分化程度明顯相關，是結直腸癌發生的早期事件〔6〕。邢洪存等〔7〕檢測58例結直腸癌組織及其鄰近的正常組織中Survivin基因mRNA的表達，發現Survivin基因mRNA在結直腸癌組織中表達明顯增高，并與病理分期、淋巴結轉移等臨床病理特征密切相關。PTTG是一種新型原癌基因，該基因位于人類第5號染色體長臂3區3帶(5q33)，含有5個外顯子和4個內含子，作用是通過抑制分裂酶的活性抑制成熟前的染色體分裂，參與生命的多個關鍵進程，如細胞有絲分裂、細胞周期的進行、細胞凋亡及DNA修復等。Heaney等〔8〕運用RT-PCR方法檢測了48例結腸癌和20例結腸息肉患者中PTTG mRNA表達，發現結腸癌和結腸息肉中PTTG mRNA的平均含量都是正常結腸黏膜的2.2倍。由于Survivin和PTTG mRNA在結直腸癌中表達均明顯增高，并且有望作為潛在的結直腸癌治療靶點，提示兩者可能存在一定的關聯性，相互促進共同參與結直腸癌的發病。

本研究表明Survivin可能與PTTG相互聯系參與結直腸癌的發生發展。然而，Survivin與PTTG相互關聯的網絡效應仍需要進一步實驗證實。相信隨著研究的不斷深入，Survivin與PTTG將會在結直腸癌的基因治療中展示出更大的價值。

1 Okon K，Demczuk S，Klimkowska A，et al.Correlation of microsatellite status，proliferation，apoptotic and selected immunohistochemical markers in colorectal carcinoma studied with tissue microarray〔J〕.Pol J Pathol，2006;57(2):105-11.

2 Abd El-Hameed A.Survivin expression in colorectal adenocarcinoma using tissue microarray〔J〕.J Egypt Natl Canc Inst，2005;17(1):42-50.

3 史美龍.Survivin特異性shRNA表達載體的構建及評價〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(11):1352-3.

4 史美龍.Survivin基因小干擾RNA對人結腸癌細胞生物學行為的影響〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(14):1733-5.

5 Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))method〔J〕.Methods，2001;25(4):402-8.

6 Kalliakmanis JG，Kouvidou C，Latoufis C，et al.Survivin expression in colorectal carcinomas:correlations with clinicopathological parameters and survival〔J〕.Dig Dis Sci，2010;55(10):2958-64.

7 邢洪存，郭芳芳，盧振霞.Survivin在結直腸癌組織中的表達及其臨床意義〔J〕.中國醫藥指南，2010;28(8):24-6.

8 Heaney AP，Singson R，McCabe CJ，et al.Expression of pituitary-tumour transforming gene in colorectal tumours〔J〕.Lancet，2000;355(9205):716-9.