阿爾茨海默病大鼠海馬膽固醇水平升高對tau蛋白磷酸化程度增加的影響

覃紅斌 魏 蕾 張京偉 唐軍民

(湖北民族學院醫學院，湖北 恩施 445000)

神經細胞內tau蛋白過度磷酸化，并由此形成異常的神經纖維纏結(NFTs)是AD的一個特征性病理變化〔1〕。神經元內正常的tau蛋白何以被磷酸化，并形成NFTs的確切病因和機制尚不清。Niemann Pick type C(NPC)病人腦同時存在膽固醇代謝失衡和NFTs，提示膽固醇與tau蛋白過度磷酸化可能存在某種聯系〔2〕。研究發現膽固醇在神經纏結變的神經元中聚集〔3〕，支持細胞內膽固醇過載與tau蛋白磷酸化有關。本研究基于上述背景，通過觀察大鼠海馬膽固醇含量升高后tau蛋白磷酸化程度的變化，探討其在AD中可能的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性SD大鼠(同濟醫學院動物中心，清潔級)，體重200～250 g，2～3月齡，常規環境飼養，隨機分為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組9只。

1.2 行為學檢測 選取40只大鼠進行1 w的Morris水迷宮訓練，遴選出36只成績相近的大鼠進行后續實驗，訓練每天1次，每次3個象限。腦立體定位注射72 h后再次進行1次水迷宮檢測，檢測1個象限。

1.3 腦立體定位注射 SD大鼠稱重，以5%水合氯醛0.6 ml/100 g腹腔注射麻醉，固定大鼠于腦立體定位儀上，使前后囟保持水平，頭頂局部剃毛，消毒。頭頂正中矢狀切口長約1.5 cm，用骨膜分離器完全分離骨膜，使前后囟暴露。以前囟為零點定標:前囟后3.8～4.5 mm，中線旁開2.0 mm，用臺式牙科鉆在雙側海馬各鉆1孔，用10μl微量注射推進器緩慢注射。對照組注射0.9%Nacl，低劑量組注射2μg/ml膽固醇，中劑量組注射8μg/ml膽固醇，高劑量組注射20μg/ml膽固醇，總劑量均為10μl/只。進針至硬膜下約3.0 mm，緩慢注入，注射完畢后留針10 min，再緩慢退針，以防藥物沿針道返回。縫合皮膚，局部涂布青霉素粉末，將動物置入籠內側臥，待其蘇醒。

1.4 組織總膽固醇含量的測定 麻醉動物并斷頭處死，迅速取出腦組織置于0～4℃生理鹽水沖洗表面血跡，置冰盤中快速分離雙側海馬，用分析天平準確稱取海馬組織，以800.0μl/50.0 mg的比例加入含2%SDS的磷酸緩沖液，冰浴勻漿，混勻30 s。取50μl移入離心管，然后加入100μl含2%SDS的磷酸緩沖液混勻。接著加入250μl氯仿∶甲醇(體積比2∶1)，混勻30 min，離心后吸取下層氯仿相，余下的溶液再次加入250μl氯仿/甲醇重復提取1次吸取下層氯仿相，兩次氯仿相溶液合并，干燥。干燥后的沉淀加入30μl異丙醇∶聚乙二醇辛基醚(體積比2∶1)，旋渦震蕩混勻2 min，再加入雙蒸水45μl，旋渦震蕩混勻2 min，該溶液即為待測液。待測液膽固醇的含量用膽固醇氧化酶-比色法(CHOD-PAP法)按照總膽固醇測定試劑盒說明書測定，總膽固醇測定試劑盒為上海榮盛生物技術有限公司產品。

1.5 免疫組織化學 用4%多聚甲醛溶液進行心臟灌注固定腦組織待取出腦組織后再在上述固定液中固定6～12 h，即可直接切片。免疫組織化學染色主要步驟參照說明書。DAB顯色，常規脫水、透明、封片。

1.6 免疫印跡 麻醉動物并斷頭處死，迅速取出腦組織置于0～4℃生理鹽水沖洗表面血跡，置冰盤中快速分離雙側海馬，以1∶9的比例加入蛋白勻漿提取液，冰水中用1 ml勻漿器制成10%的蛋白勻漿，離心10 min，取上清備用。用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白含量，保證每泳道加入相同量蛋白。電泳結束后將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉移至PVDF膜。加入一抗tau-1(識別Ser-198/Ser-199/Ser-202非磷酸化位點，多克隆抗體，1∶1 000)、PHF-1(識別 Ser-396/Ser-404 磷酸化位點，單克隆抗體，1∶1 000)和R134d抗體(識別tau磷酸化和非磷酸化位點，多克隆抗體，1∶1 000)，以上抗體均購自 SAB公司，4℃過夜，加入熒光標記二抗，37℃孵育1 h，odyssey成像系統顯色。1.7 統計學處理 采用SPSS12.0統計軟件行t檢驗及單因素方差分析。

2 結果

2.1 給藥72 h后行為學測試 如表1所示給藥72 h后水迷宮，對各組給藥后潛伏期，穿越平臺次數作單向方差分析，低劑量組有變化(P＜0.05)，中劑量，高劑量組較對照組變化明顯(P ＜0.01)。

表1 各組給藥后潛伏期變化(x ± s，n=9)

2.2 海馬膽固醇含量 與對照組比較〔(0.60±0.40)mg/g〕，低劑量組略增高 〔(0.64 ±0.01)mg/g，P ＜0.05〕，中、高劑量組明顯增高 〔(1.18 ±0.03)、(1.31±0.03)mg/g，P ＜0.01〕。

2.3 免疫組化結果 因背景色不一，以R134d標準化PHF-1與tau-1后，大鼠海馬免疫組化染色結果顯示:tau蛋白主要分布在大鼠海馬CA3區，PHF-1染色顯示隨腦膽固醇含量增高，tau S396/S404位點磷酸化水平也隨之增高，低劑量組有變化(P＜0.05)，中劑量組，高劑量組升高明顯(P＜0.01)。tau-1染色顯示隨腦膽固醇含量增高，tau S198/S199/S202位點非磷酸化水平也隨之降低，且中劑量組，高劑量組降低明顯(P＜0.01)。R134d示總tau無明顯變化(圖1，表2)。

2.4 免疫印跡結果 雙側海馬給藥72 h后，大鼠海馬免疫印跡結果顯示:β-actin示上樣無組內差異，以R134d標準化PHF-1與tau-1后，PHF-1染色顯示隨腦膽固醇含量增高，tau S396/S404位點磷酸化水平也隨之增高，低劑量組有變化(P＜0.05)，且中劑量組，高劑量組升高明顯(P＜0.01)。tau-1染色顯示隨腦膽固醇含量增高，tau S198/S199/S202位點非磷酸化水平也隨之降低，且中劑量組，高劑量組降低明顯(P＜0.01)。R134d示總tau無明顯變化(圖2，表3)。

圖1 三種tau蛋白抗體的免疫組化(DAB，×200)

圖2 三種tau蛋白抗體的免疫印跡

表2 三種tau蛋白抗體的免疫組化(n=9)

表3 三種tau蛋白抗體的免疫印跡(n=9)

3 討論

本研究結果發現隨膽固醇含量逐漸升高，tau去磷酸化程度逐漸降低，相反磷酸化程度逐漸升高，且動物的空間記憶能力也隨腦膽固醇含量的升高而下降。高膽固醇水平能夠促進腦內淀粉樣前體蛋白(APP)經β分泌酶降解為β淀粉樣蛋白(Aβ)〔4〕，在某些特殊的部位，膽固醇的更新非常活躍，如海馬神經元突觸后膜上的膽固醇，24 h內有20%以上被更新〔5〕，膽固醇在腦的代謝對腦細胞的生長、神經修復和重塑有重要作用。由此可見，膽固醇的含量對于學習和記憶的影響效果顯著。雖然已知膽固醇在72 h內可以導致tau過度磷酸化，但也有另一項神經元培養研究顯示，膽固醇水平的減少促進tau蛋白磷酸化〔7〕，對這種矛盾現象的解釋是，tau蛋白磷酸化與細胞膽固醇量無關，而與細胞的特殊區域(如CRDs)有關，可能是該特殊區域傳導著導致tau蛋白磷酸化的信號，這可能與膽固醇富載后神經元內相應的蛋白激酶和、或酯酶的變化有一定的關系，也有研究顯示，膽固醇過少會抑制樹突的延伸和突觸的生成，并認為這可能與tau蛋白磷酸化有關〔7〕。研究已發現在諸多降低膽固醇藥物中，他汀類(32羥基-32甲基-戊二酰輔酶A還原酶抑制劑)在對抗AD特異病理變化方面是最有效的〔8〕，但其具體機制還不清楚。膽固醇與AD關系的深入研究，可能會給AD治療帶來新的曙光，但還需要深入研究膽固醇在中樞神經系統的代謝機制。

1 龔成新，王建枝.tau蛋白在老年性癡呆癥神經原纖維退行性變中的作用〔J〕.醫學分子生物學雜志，2006;3(3):163-9.

2 Carstea ED，Morris JA，Coleman KG，et al.Niemann-Pick C1 disease gene:homology to mediators of cholesterol homeostasis〔J〕.Science，1997;277:288-31.

3 Fan QW，Yu W，Senda T，et al.Cholesterol dependent modulation of tau phosphorylation in cultured neurons〔J〕.J Neurochem，2001;76:391-400.

4 Sparks DE，Martin TA，Gross DR，et al.Link between heart disease，cholesterol，and Alzheimer's disease:a review〔J〕.Microsc Res Tech，2000;50(2):287-90.

5 Distl R，Meske V，Ohm TG.Tangle bearing neurons contain more free cholesterol than AD jacent tangle free neurons〔J〕.Acta Neuropathol(Berl)，2001;101:547-54.

6 Simons M，Keller P，Dichgans J，et al.Cholesterol and Alzheimer's disease:is there a link〔J〕?Neurology，2001;57(6):1089-93.

7 Masumura M，Hata R，Uramoto H，et al.Altered expression of amyloid precursors proteins after traumatic brain injury in rats:in situ hybridization and immunohistochemical study〔J〕.J Neurotrauma，2000;17(1):123.

8 Marx J.Alzheimer's disease:BAD for the heart，BAD for the mind〔J〕.Science，2001;294:508.