嗅成鞘細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞共移植對(duì)阿爾茨海默病大鼠的治療作用

姚柏春 孫天敏 馮 娜 王 軍 唐慕湘 王金勇 王配軍

(湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰 442000)

臨床治療阿爾茨海默病(AD)主要是改善患者學(xué)習(xí)記憶功能，無(wú)法補(bǔ)充大腦皮層、基底前腦和海馬大量丟失的神經(jīng)元、神經(jīng)突觸和神經(jīng)遞質(zhì)。已有研究應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)移植治療AD，但效果不夠理想〔1，2〕。本研究用嗅成鞘細(xì)胞(OECs)與NSCs共移植于A(yíng)D大腦，探討其對(duì)AD的作用，為臨床有效治療AD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 健康雄性SD大鼠，SPF級(jí)，7～9月齡，體重250～300 g;另孕16～18 d SD大鼠4只，均由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔許可證號(hào):SCXK(鄂)2005-0008〕提供。DMEM/F12、無(wú)血清培養(yǎng)液添加劑 B27、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、Hoechst33258、胰蛋白酶(Gibco);20%胎牛血清FBS(PAA);突觸素抗體(Sigma);兔抗鼠Nestin單克隆抗體、鼠抗鼠NF200單克隆抗體(Santa Cruz);大鼠β淀粉樣蛋白1-40(Aβ1～40)(Biosource);多聚賴(lài)氨酸、兔抗鼠GFAP多克隆抗體、小鼠抗大鼠P75多克隆抗體、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)抗體、羊抗鼠IgG:TRITC(武漢博士德)。

1.2 OECs培養(yǎng)及鑒定〔3，4〕無(wú)菌條件下剖腹取8～10只SD胎鼠(孕 16～18 d)嗅球最外二層(神經(jīng)層、小球?qū)?，經(jīng)0.125%(W/v)胰蛋白酶消化和機(jī)械吹打分散成單細(xì)胞懸液，以1×106/ml細(xì)胞密度種植于含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液的25 cm2玻璃培養(yǎng)瓶中;在培養(yǎng)的第12和24小時(shí)分別進(jìn)行兩次差速貼壁處理;第7天加入5×10-5mol/L的阿糖胞苷(Ara-C)，作用48 h(除去成纖維細(xì)胞)后全量換液消除Ara-C的作用;加入bFGF 10 ng/ml培養(yǎng)5 d，擴(kuò)增OECs;以后每3天半量換液一次。每天在倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察并攝片，記錄細(xì)胞生長(zhǎng)情況。第14天按照ABC法進(jìn)行神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(NGFRp75)免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，并計(jì)算OECs的純度;收集培養(yǎng)細(xì)胞(密度為1×107/ml)備用或凍存。

1.3 NSCs培養(yǎng)及鑒定〔5〕無(wú)菌條件下剖腹取8～10只SD胎鼠(孕16～18 d)，分離大腦皮質(zhì)，放入D-Hank's液漂洗2次，轉(zhuǎn)移至4℃基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用鑷子在解剖顯微鏡下仔細(xì)分離、除去表面毛細(xì)血管及軟腦膜，用眼科剪剪碎組織塊至0.5 mm3大小。用滴管吸入離心管、反復(fù)吹打后，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾，濾液離心800 r/min 5 min去上清、重懸，臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)、以1×106/ml細(xì)胞密度接種于含完全培養(yǎng)液的25 cm2培養(yǎng)瓶中，移入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天用倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度2～3 d半量換液，換液后，以玻璃滴管酌情吹打，使增殖的神經(jīng)球盡量散開(kāi)。當(dāng)大部分神經(jīng)球增大到100～200個(gè)細(xì)胞左右時(shí)進(jìn)行傳代。用特異性抗原Nestin免疫熒光染色鑒定 NSCs。收集培養(yǎng)細(xì)胞(密度為1×107/ml)備用或凍存。

1.4 OECs和NSCs共培養(yǎng) NSCs懸液的制備。取SD胎鼠(孕16～18 d)大腦皮層組織，搗碎、過(guò)濾，收集細(xì)胞培養(yǎng)、傳代，所獲NSCs進(jìn)行Nestin免疫熒光鑒定，并以Hoechst33258熒光標(biāo)記NSCs，以800 r/min離心5 min，最后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/μl。OECs懸液的制備。取SD胎鼠(孕16～18 d)嗅球，搗碎并用胰酶消化，所得細(xì)胞培養(yǎng)、傳代純化，獲取OECs進(jìn)行NGFRp75免疫熒光鑒定，以800 r/min離心5 min，最后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/μl。原代OECs生長(zhǎng)到10 d左右，待其貼壁，棄去OECs的血清培養(yǎng)液，用無(wú)菌PBS浸洗三次，后將傳代后懸浮生長(zhǎng)約5 d的神經(jīng)球加于OECs上，使OECs和NSCs共用一個(gè)培養(yǎng)液體系，此時(shí)培養(yǎng)液更換為維持培養(yǎng)液，每3天半量換液。每天在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞增殖情況。

1.5 建立大鼠 AD模型 將 Aβ1～40溶于無(wú)菌生理鹽水(5μg/ml)，放入37℃溫箱孵育2 w，使其變成絲狀聚集狀態(tài)。用35 g/L的戊巴比妥鈉(35 g/kg)將大鼠麻醉，雙側(cè)海馬注射2 μl(10 μg)Aβ1～40，10 min 內(nèi)注完，并留針 10 min。單籠飼養(yǎng)至大鼠完全清醒，肌肉注射慶大霉素。Aβ1～40海馬注射后第7天用Y型電迷宮檢測(cè)，若大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退，隨機(jī)從其中抽取10%經(jīng)Nissl、剛果紅組織學(xué)染色，出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞減少、Aβ斑和老年斑(SP)，則該批大鼠確定為AD模型成功鼠。將AD模型鼠隨機(jī)分為NSCs移植組、NSCs與OECs移植組、AD模型組，各30只，另正常對(duì)照組30只SD健康大鼠共4組。

1.6 各組大鼠細(xì)胞移植

1.6.1 Hoechst33258熒光標(biāo)記NSCs 離心收集好的細(xì)胞里加入新鮮DMEM/F12培養(yǎng)基3～4 ml，移液管反復(fù)吹打形成細(xì)胞懸液，加入核熒光標(biāo)記物 Hoechst33258，使之作用濃度為10μg/ml，迅速晃動(dòng)混勻后移入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，取少量懸液進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整OECs濃度為5×106/ml備用。

1.6.2 細(xì)胞移植操作 將AD模型成功鼠在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繼續(xù)普食喂養(yǎng)1 w，即Aβ1～40海馬注射2 w后，用于下一步實(shí)驗(yàn)。用戊巴比妥鈉將大鼠麻醉，用微量進(jìn)樣器給藥，注射速度為0.5μl/min。①NSCs移植組:兩側(cè)移植點(diǎn)各注射N(xiāo)SCs細(xì)胞懸液5μl(約含5×104個(gè)細(xì)胞)。②NSCs與OECs共移植組:注射N(xiāo)SCs與OECs細(xì)胞懸液5μl(約含5×104個(gè) NSCs、5×104個(gè)OECs)。③AD模型組:注射5μl 0.85%的鹽水。④正常對(duì)照組:不作任何處理。被移植注射的NSCs進(jìn)行過(guò)熒光標(biāo)記。骨蠟封閉顱骨，縫合頭皮。單籠飼養(yǎng)至大鼠完全清醒，肌肉注射青霉素，密切觀(guān)察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4 w。

1.7 行為學(xué)測(cè)試 細(xì)胞移植后第4周開(kāi)始，用Morris水迷宮測(cè)試各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

1.8 免疫組織化學(xué)染色 行為學(xué)測(cè)試后，細(xì)胞移植后第28天，將各組大鼠麻醉后打開(kāi)胸腔，經(jīng)左心室、主動(dòng)脈快速灌注200 ml生理鹽水(右心耳切開(kāi))洗凈血液，然后固定。1 h后取腦，后固定2 h，放入150，200，300 g/L蔗糖磷酸鹽緩沖液，梯度脫水，隔夜沉底。OCT包埋后入 -70℃冷丙酮速凍，移至-28℃恒冷箱冰凍切片機(jī)平衡溫度后連續(xù)冠狀切片，片厚30μm。①熒光免疫組織化學(xué)染色:取相鄰海馬腦切片，4℃丙酮固定10 min，晾干;0.3%H2O2室溫10 min;0.125%胰酶消化15 min;2%正常山羊血清封閉，室溫孵育15 min;滴加一抗(抗NF-200抗體，1∶400;抗 GFAP抗體，1∶50;抗 ChAT抗體，1∶400)，4℃孵育 24 h;滴加 1∶50 稀釋的 TRITC 標(biāo)記 IgG，37℃孵育40 min。甘油緩沖液封片。0.02 mol/L PBS做陰性對(duì)照。②免疫組織化學(xué)染色法:一抗為抗 SYN抗體(1∶200)、NGFRp75 抗體(1∶200)。

1.9 圖像處理 每只大鼠取含海馬注射點(diǎn)對(duì)應(yīng)部位5張不同斷面切片，這些切片在4組保持?jǐn)嗝嬉恢隆Ｃ總€(gè)指標(biāo)計(jì)數(shù)5張染色切片，每張染色切片光鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)非重疊視野(200倍)，分別計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比例(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))，結(jié)果用百分率表示。采用Leica圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行積分吸光度(IA)測(cè)定。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均用x±s表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化 細(xì)胞移植后第4周，與AD模型組比較，NSCs移植組潛伏期明顯縮短、通過(guò)平臺(tái)次數(shù)明顯增加(P＜0.05);與NSCs移植組比較，NSCs與OECs移植組的潛伏期、通過(guò)平臺(tái)次數(shù)有顯著性差異(P＜0.05)，接近正常對(duì)照組(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果比較(x±s)

2.2 移植細(xì)胞的存活和遷移 ①NSCs:細(xì)胞移植4 w后，在熒光顯微鏡下觀(guān)察腦片，Hoechst33258標(biāo)記的移植細(xì)胞呈黃綠色熒光，細(xì)胞大多呈圓形，大小不一。移植細(xì)胞遷移較明顯，除移植位點(diǎn)和針道內(nèi)有密集黃綠色亮點(diǎn)或團(tuán)塊外，部分移植細(xì)胞沿海馬回向兩側(cè)遷移，并排列成黃綠色條帶狀。在海馬回內(nèi)，遷移細(xì)胞向內(nèi)側(cè)接近第三腦室，向外側(cè)達(dá)到側(cè)腦室上方。②OECs:倒置顯微鏡下觀(guān)察，OECs移植28 d后，大鼠的大腦組織切片中有大量P75 DAB顯色陽(yáng)性的細(xì)胞，表明植入腦內(nèi)的OECs存活數(shù)量較多，并且從注射部位分別向兩側(cè)海馬區(qū)及其周?chē)べ|(zhì)遷移。

2.3 移植細(xì)胞NSCs的分化 NSCs移植4 w后，免疫熒光檢測(cè)明顯可見(jiàn) NF-200、GFAP、ChAT免疫陽(yáng)性反應(yīng)。Hoechst33258/NF-200雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞，多位于移植細(xì)胞的周邊部位，其雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)為成熟神經(jīng)元，胞體中央細(xì)胞核大而圓，胞漿少，細(xì)胞膜發(fā)起突起，可見(jiàn)延伸較長(zhǎng)的軸突。Hoechst33258/GFAP雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞，多位于大腦皮層，胞體中央有一個(gè)大而圓的核，胞漿少，有多個(gè)較長(zhǎng)的突起，細(xì)胞形態(tài)已發(fā)育成熟。可見(jiàn)到少量Hoechst33258/ChAT雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞，胞核大，胞漿少，為圓形或橢圓形。移植組移植神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的百分率及其比較見(jiàn)表2。

表2 移植組移植神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的百分率比較(x±s，%，n=30)

2.4 大鼠海馬突觸素的表達(dá) 突觸素的表達(dá)呈顆粒狀，主要分布在海馬CA1、CA3區(qū)多形層、分子層以及齒狀回，沿其長(zhǎng)軸呈點(diǎn)狀走行。正常對(duì)照組IA為(0.429±0.147)，AD模型組為(0.276±0.107)，NSCs移植組較 AD模型組明顯增多〔(0.355±0.119)，P ＜0.05〕，NSCs與 OECs移植組與 NSCs移植組明顯增多〔(0.417±0.139)，P ＜0.05〕。

3 討論

NSCs移植作為AD的一種新興治療方法。NSCs移植治療AD的效果在很大程度上取決于植入的NSCs分化為神經(jīng)元的多少及其在結(jié)構(gòu)和功能上與宿主神經(jīng)系統(tǒng)的整合程度，也就是說(shuō)，移植到體內(nèi)的NSCs分化的神經(jīng)元要發(fā)揮治療作用必須與宿主神經(jīng)元形成突觸連接，建立功能性神經(jīng)回路，釋放神經(jīng)遞質(zhì)，產(chǎn)生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或保護(hù)因子，改變腦組織對(duì)損傷的反應(yīng)，幫助受損神經(jīng)元修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明體外培養(yǎng)的NSCs移植后在A(yíng)D大鼠腦內(nèi)能夠存活，并沿海馬回向兩側(cè)遷移，能分化形成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，特別是膽堿能神經(jīng)元能有效改善AD模型鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力。

然而，我們觀(guān)察到，移植入AD大鼠腦內(nèi)的NSCs分化形成的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量并不是很多。國(guó)內(nèi)外研究〔2，5〕也證實(shí)了這一點(diǎn)。這可能與下列因素有關(guān):①AD腦海馬區(qū)域內(nèi)的微環(huán)境與離體血清誘導(dǎo)分化的微環(huán)境有明顯的不同，微環(huán)境差異影響了NSCs的存活、遷移與分化;②作為干細(xì)胞的標(biāo)記物，Hoechst33258在DNA修復(fù)過(guò)程中會(huì)逐漸消失，導(dǎo)致了觀(guān)察的誤差。所以有必要尋找更好的標(biāo)記手段，如綠色熒光蛋白(GFP)或Lac Z基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞(下一步工作)。因此，對(duì)NSCs在體外適當(dāng)誘導(dǎo)，使其分化為神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞再進(jìn)行移植;或者直接移植于A(yíng)D腦病變區(qū)域并采用某種因素改善局部的微環(huán)境，有可能取得更好的移植效果。

本研究表明，NSCs與OECs共同移植更有利于提高NSCs分化為神經(jīng)元的分化率，更有利于A(yíng)D大鼠海馬CA1區(qū)突觸素的表達(dá)。我們認(rèn)為，其可能的原因?yàn)樾岢汕始?xì)胞通過(guò)五個(gè)方面〔6〕:①OECs分泌的神經(jīng)生長(zhǎng)因子與神經(jīng)元表達(dá)的相應(yīng)受體結(jié)合，②OECs膜表面黏附分子的作用，③OECs的成鞘作用，④OECs的遷移性，⑤OECs抑制膠質(zhì)增生等，為NSCs的生存提供一個(gè)適宜生長(zhǎng)條件，從而使NSCs的生長(zhǎng)增殖達(dá)到一個(gè)相對(duì)良好的階段，從而提高NSCs的存活、增殖和分化率，特別是促進(jìn)分化的神經(jīng)元軸突再生，建立植入神經(jīng)元與宿主腦神經(jīng)元之間的聯(lián)系，從而改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及病理?yè)p害。

1 楊 春，白琳琳，王書(shū)春，等.神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)阿爾茨海默病大鼠海馬神經(jīng)分化和功能的影響〔J〕.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2009;44(4):751-4.

2 楊 春，白琳琳，王書(shū)春，等.移植入阿爾茨海默病大鼠海馬內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的存活、遷移和分化〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010;30(6):779-81.

3 袁碧波，蔡文琴，孫 榆.嗅球成鞘細(xì)胞的培養(yǎng)純化及與功能相關(guān)的形態(tài)學(xué)研究〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003;25(17):1540-3.

4 范志海，沈憶新.成年大鼠嗅球和嗅黏膜嗅鞘細(xì)胞的培養(yǎng)純化與生物學(xué)特性的研究〔D〕.蘇州大學(xué)，2006.

5 穆麗芳，何 成.嗅鞘細(xì)胞體外誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化的研究〔D〕.第二軍醫(yī)大學(xué)，2008.

6 趙君朋，雷季良.嗅成鞘細(xì)胞移植促中樞神經(jīng)再生的研究進(jìn)展〔J〕.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2003;19(3):334-7.