益氣活血法改善缺血性腦卒中急性期大鼠微循環障礙的機制

邱 樂 王新生 劉 擎

(解放軍458醫院，廣東 廣州 510602)

中風分為出血性中風和缺血性中風。在我國，約85%的缺血性中風急性發作(acute ischemic stroke，AIS)具有發病率高、死亡率高、致殘率高、復發率高以及并發癥多的特點。有研究表明AIS患者氣虛血瘀證達73%，故益氣活血法是AIS的重要治療方法，尤以黃芪注射液和燈盞細辛注射液為臨床常用藥物。本研究通過復制AIS大鼠模型，研究黃芪注射液和燈盞細辛注射液對改善AIS大鼠微循環的作用機制，為指導AIS的臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 健康老年SD大鼠60只，體質量(270±30)g(廣州中醫藥大學實驗動物中心提供)。治療用藥:①黃芪注射液〔10 ml/支(相當于原藥材20 g)，國藥準字Z33020179，正大青春寶藥業有限公司〕;②燈盞細辛注射液(10 ml/支，國藥準字Z53021569，云南生物谷燈盞花藥業有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將60只SD大鼠隨機取15只做假手術組;余行AIS模型制備，術后45只隨機取15只做模型組，余30只為治療組。

1.2.2 模型制作 采用多因素復合方法復制氣虛血瘀證動物模型，頸總動脈結扎并改良線栓法復制腦缺血動物模型。

1.2.2.1 氣虛血瘀模型 參照文獻〔1〕，采用饑餓、冷水疲勞游泳結合高脂飲食的方法造模。①饑餓:先測得大鼠正常飲食量，僅按正常飲食量60%喂養。②冷水疲勞游泳:將大鼠每日于水溫(10±0.2)℃、深30 cm水桶中，棒打促使其持續游泳，至疲勞開始下沉時撈出，自然風干，不采取保暖措施。③高脂飲食:上述步驟處理后，再予脂肪乳灌胃，劑量按大鼠體重系數折算，予10 ml/kg灌胃，1次/d。以上方法持續7 d。造模成功標準:精神萎靡，倦怠嗜睡，毛發無光澤或結穗或稀疏脫落，稀便，舌淡或紫暗，眼球暗紅，四肢或尾部出現瘀點瘀斑等。

1.2.2.2 大鼠局灶性腦梗死模型 參照文獻〔2，3〕，采用頸總動脈結扎并改良線栓法造模。所有造模大鼠術前均禁食1 d，予腹腔內注射20%烏拉坦(900 mg/kg)麻醉，仰臥位固定大鼠，頸部常規備皮消毒后，沿頸部正中切開，鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌，暴露并分離右側頸總動脈與迷走神經，于近頸內外動脈分叉處結扎頸外動脈。夾閉頸總動脈、頸內動脈。近頸總動脈分叉約5 mm處針刺破入并將栓線插入頸總動脈，松開微動脈夾，將插線插入頸內動脈，進線深度(19±0.5)mm。將栓線與頸總動脈結扎固定，消毒術區，縫合筋膜、皮膚。外用甲硝唑粉預防感染。假手術組除不插栓線外，其余手術步驟同模型組。造模成功的標準:蘇醒后左上肢屈曲，行走時向左側旋轉或左側肢體癱瘓，或伴右側Horner征。不符合標準的動物剔除。

1.2.3 給藥方法 各組大鼠均于造模成功10 min后給藥，劑量參考人與大鼠體重系數折算標準〔4〕。治療組予以腹腔注射黃芪注射液(3.2 ml/kg)及燈盞細辛注射液(3.6 mg/kg)，假手術組與模型組腹腔注射等量生理鹽水;每日1次，療程4 d。室溫下飼養，自由飲食飲水，自然晝夜。

1.2.4 觀察指標 各組大鼠分別于治療前后檢測血管內皮素(ET)、5-羥色胺(5-HT)、D-D 二聚體(D-Dimer，D-D)、血栓烷素A2(TXA2)、前列環素(PGI2)、熱休克蛋白70(HSP70)mRNA;并在治療 0、12、24、48、72、96 h 分別作大鼠神經功能 ZeaLonga評分。

1.2.4.1 大鼠神經功能ZeaLonga評分〔1〕①無神經功能缺失癥狀，活動正常(0分);②不能完全伸展對側前爪(1分);③動物爬行時出現向左轉圈(追尾現象)(2分);④身體向偏癱側傾倒(3分);⑤不能自發行走，意識喪失(4分)。分別剔除評分為0分和4分者。

1.2.4.2 檢測方法 運用放射免疫法測定血漿 ET、TXA2、PGI2水平，用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血漿D-D水平，以RF-510型熒光分光光度計測定大腦皮層5-HT水平，用Northern印跡檢測腦組織HSP70 mRNA水平。

1.3 統計學方法 應用SPSS18.0統計軟件進行分析，計量資料以x±s表示，組間均數比較采用t檢驗;神經功能缺損評分采用重復測量資料的方差分析;各微循環指標治療前后比較采用析因設計資料的方差分析。

2 結果

2.1 大鼠神經功能ZeaLonga評分 模型組96 h評分與同組12 h評分差異有統計學意義(P＜0.05)，治療組72、96 h評分與同組24 h評分，治療組96 h與同組48 h評分差異有統計學意義(P ＜0.05);且治療組 24、48、72、96 h評分與模型組同一時點評分差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.2 微循環指標 (1)各組內比較:模型組治療后的5-HT、TXA2、HSP70 mRNA水平與治療前比較均有顯著差異(P＜0.05)，表明AIS部分微循環指標可于發病4 d內的非治療狀態下自行緩解;治療組治療后的各指標水平與治療前比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，表明益氣活血法對AIS各微循環指標均有不同程度的改善作用。(2)各組間比較:治療前的假手術組各指標水平與模型組、治療組比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，表明所選大鼠造模成功后AIS微循環障礙的各指標均有不同程度惡化;治療后治療組的ET、D-D、TXA2、HSP70 mRNA水平與模型組比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，表明益氣活血法對AIS部分微循環指標的改善優于其自行緩解;治療后的治療組D-D水平與假手術組無顯著差異(P＞0.05)，表明益氣活血法治療后，D-D水平可改善至近似發病前的正常水平。見表2。

表1 各組大鼠不同時點神經功能ZeaLonga評分比較(x±s)

表2 治療前后各組微循環指標比較(x±s)

3 討論

AIS腦損傷的主要機制為興奮性氨基酸毒性、氧化應激、炎癥反應、線粒體損傷，而微循環損傷是其核心之一。ET、5-HT、D-D、TXA2、PGI2、HSP70 mRNA為反映微循環障礙及由此引起神經元損傷的重要指標。

AIS的缺氧和機體應激反應能迅速誘導腦組織ET高表達，導致腦微循環功能紊亂及由此所致的神經元損傷。ET一方面可致腦血管強烈收縮痙攣，腦血流量急劇下降而致腦組織缺血缺氧，導致和加重腦缺血再灌注損傷;另一方面對神經細胞產生細胞毒性作用，加劇腦水腫的發生發展，造成腦組織的嚴重損傷〔5〕。

5-HT為內源性的血管活性因子，也是中樞神經系統重要的神經遞質，具有重要的血管活性作用〔6〕。缺血性腦損傷的單胺遞質假說認為:①腦缺血可致細胞外5-HT濃度迅速升高。有研究發現全腦缺血后多個腦區均存在單胺類遞質紊亂，進一步揭示了單胺類遞質與腦缺血損傷之間的密切聯系。②腦缺血時血小板活性增高，釋放功能增強，也可致5-HT升高。③5-HT可通過直接興奮血管平滑肌的5-HT2受體，增強其他內源性縮血管物質作用以及促進腎上腺能神經元末梢釋放去甲腎上腺素而使腦血管收縮，加重腦組織缺血損傷。

D-D是交聯纖維蛋白在纖溶酶作用下產生的一種特異性的最終降解產物。D-D升高表明血栓形成和溶解均增強，高水平D-D可預示缺血性腦血管疾病的發生。凝血酶水解纖維蛋白原產生可溶性纖維蛋白單體(SFM)，進而形成具有穩定、堅固、不再溶解特點的交聯纖維蛋白，故而凝血;纖維凝血6 h后血栓即發生繼發性纖維蛋白溶解，纖溶酶降解纖維蛋白原、SFM及關聯纖維蛋白，D-D就是其中一種降解產物。D-D增高提示繼發性纖溶活性增強，可作為體內高凝狀態和纖溶亢進的特異性血液學分子標記物〔7〕。

TXA2和PGI2為調節血管張力的一對天然的拮抗物，都具有重要的血管活性作用。TXA2是由血小板微粒體合成并釋放的一種具有強烈促進血管收縮和血小板聚集的生物活性物質，PGI2是由血管內皮細胞合成并釋放的一種具有抗血小板聚集和舒張血管的生物活性物質。正常情況下，二者在腦組織內保持動態平衡，以維持腦血管穩定和血流通暢。腦缺血時，Ca2+超載致花生四烯酸(AA)明顯增多;再灌注時，腦組織內堆積的AA經環氧合酶生成不穩定的中間代謝產物PGG2和PGH2，再經過合成酶催化分別生成TXA2與PGI2。但再灌注期間腦組織產生的大量氧自由基可損傷血管內皮細胞，抑制PGI2合成酶，使得PGI2減少而TXA2合成相對過多，導致TXA2/PGI2比例失衡，腦組織微循環障礙進一步加重，出現繼發性缺血、缺氧，加重腦繼發性損害〔8〕。

HSP是一類在進化上高度保守、在機體發生應激反應時誘導產生的保護性蛋白，其中HSP70是HSP家族中最主要的一類〔9〕。動物實驗表明，HSP70對腦缺血受損的神經元有神經保護作用，可能與其作為伴侶蛋白促進蛋白質正確折疊、抑制細胞凋亡等作用有關〔10〕。黃芪注射液等許多藥物能誘導HSP70表達升高或降低，通過不同的途徑起到神經保護作用〔11〕。

AIS所致的微循環障礙以及由此所致的神經元的損傷，都會導致 ET、5-HT、D-D、TXA2、PGI2、HSP70 mRNA 的高表達以及比例失衡。故而針對上述指標的研究，可以反映藥物對AIS缺血損傷時腦微循環障礙及神經功能缺損的改善作用。

AIS屬祖國醫學“中風”范疇。清代醫家王清任認為，“元氣既虛必不能達于血管，血管無氣，必停留而瘀”，因而提出中風的氣虛血瘀論。臨床研究表明，氣虛血瘀證為中風的主要中醫證候，故益氣活血法是AIS的重要治療方法。黃芪注射液及燈盞細辛注射液為益氣活血法的臨床常用藥物;黃芪注射液為黃芪提取物制成的針劑，具有補氣升陽、利水消腫作用〔12〕;燈盞細辛注射液為燈盞細辛經提取酚酸類成分制成的滅菌水溶液〔13〕，功以散寒解表、祛風除濕、活血化淤、通絡止痛。臨床研究報道，兩者合用可明顯降低血漿纖維蛋白原水平，改善血液循環狀態，從而減輕神經功能缺損，改善患者臨床癥狀，且安全性高。

本研究結果提示，AIS發病后4 d內其整體神經功能有明顯的自行緩解作用;發病后24～96 h，益氣活血法對AIS整體神經功能的改善優于其自行緩解過程，且發病后4 d內益氣活血法對AIS整體神經功能的改善逐漸明顯。

本研究提示，以黃芪注射液及燈盞細辛注射液為代表的益氣活血法，能夠改善AIS的整體神經功能評分;ET、5-HT、D-D、TXA2、PGI2、HSP70 mRNA高表達是AIS微循環障礙的重要機制與指標，益氣活血法能夠通過調整各微循環障礙指標的表達，尤其下調D-D的高表達，改善AIS微循環，從而促進整體神經功能的恢復。今后研究有待于深化AIS微循環改善的具體機制，進一步推廣益氣活血法治療AIS的臨床應用。

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