益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)方對糖尿病腎病大鼠血管內(nèi)皮生長因子信號通路的影響

郭立芳 王鳳麗 王月華 丁英鈞 陳志強

(河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

糖尿病腎病(DN)是個漸進(jìn)性的腎臟疾病且代表了糖尿病嚴(yán)重的晚期并發(fā)癥，目前仍缺乏有效的治療手段。我們以“久病入絡(luò)”理論為指導(dǎo)，提出氣陰兩虛、癥積絡(luò)阻為DN基本病機，以益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)為DN的治療大法。而前期研究中我們已經(jīng)證實該法能夠通過對DN大鼠TGF-β/Smads、氧化應(yīng)激及RAS系統(tǒng)的影響發(fā)揮對DN的治療作用〔1～6〕?，F(xiàn)代研究表明，足細(xì)胞及其裂孔隔膜上的裂孔膜蛋白與蛋白尿的發(fā)生密切相關(guān)，而血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)能增加腎小球濾過屏障對血漿蛋白的通透性，其過表達(dá)參與了DN蛋白尿的發(fā)生。因此本研究繼以DN動物模型，觀察益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)法對DN大鼠VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，為中藥復(fù)方制劑延緩DN提供現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗研究選用雄性SD大鼠70只，清潔級，體質(zhì)量為(200±10)g，由河北醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，合格證號:703058。

1.2 實驗藥物 益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)中藥，由黃芪、玄參、地龍、鱉甲、丹參、大黃、烏梢蛇、水蛭、全蟲等組成，經(jīng)粉碎、水煎濃縮至含生藥3 g/ml(河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)院制劑室提供)。厄貝沙坦組予大鼠厄貝沙坦片(批號為0809155，由杭州賽諾菲圣德拉堡民生制藥有限公司生產(chǎn))15 mg·kg-1·d-1。

1.3 方法

1.3.1 動物的分組及造模 選用雄性SD大鼠70只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，分別置代謝籠里取尿，測定尿蛋白及尿紅細(xì)胞全部陰性，60只大鼠均行腹腔注射STZ(55 mg·kg-1·d-1)一次，3 d后測空腹血糖≥16.7 mmol/L隨機分為模型組、中藥組及厄貝沙坦組，開始灌胃給藥。分別于實驗第4、8、12、16、20、24周于代謝籠里留取24 h尿量后，股動脈取血并取右側(cè)腎組織待測。

1.3.2 免疫組化方法檢測VEGF、Flt1的表達(dá)情況 脫水后常規(guī)石蠟包埋，制成蠟塊，切成5μm厚的連續(xù)切片，附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上。按照SP免疫組化染色試劑盒要求操作。半定量分析:采用多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)，進(jìn)行400倍的顯微照相，每張切片鏡下隨機選取5個視野，在光亮度和放大倍數(shù)一致的條件下觀察腎臟陽性產(chǎn)物的分布、染色情況。

1.3.3 Western印跡方法檢測VEGF、Flt1的表達(dá)情況 用RIPA蛋白裂解液提取腎組織總蛋白，采用Bradford法測定蛋白濃度;取腎組織裂解蛋白50μg，經(jīng)15%SDS-PAGE垂直凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜;5%脫脂奶粉室溫封閉1 h;加一抗，4℃過夜，加二抗，室溫2 h，以上兩步后TBST洗膜10 min×3次;DAB顯色;Gene圖像分析儀攝像、分析，目的蛋白相對含量以目的蛋白/β-actin(內(nèi)參)的灰度比值表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析，組間兩兩顯著性比較采用最小顯著差異(LSD)法。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化方法檢測VEGF、Flt1的表達(dá) VEGF主要表達(dá)于腎小球臟層上皮細(xì)胞，F(xiàn)lt1則主要表達(dá)于腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，在腎小球壁層上皮細(xì)胞也有部分表達(dá)。半定量分析顯示，模型組及兩治療組較正常組VEGF及Flt1的表達(dá)顯著升高(P＜0.01);厄貝沙坦組、中藥組與模型組相比，VEGF及Flt1的表達(dá)均顯著下降(P＜0.05);厄貝沙坦組與中藥組比較無明顯差異(P＞0.05)。見表1。

2.2 Western印跡方法檢測VEGF、Flt1的表達(dá) 與正常組比較，模型組及兩治療組 VEGF及Flt1的表達(dá)顯著升高(P＜0.01);與模型組比較，厄貝沙坦組及中藥組VEGF和Flt1的表達(dá)均顯著下降(P＜0.01);厄貝沙坦組與中藥組比較無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

表1 各組大鼠VEGF和Flt1蛋白表達(dá)半定量分析結(jié)果(x±s)

表2 各組大鼠VEGF和Flt1相對蛋白含量比較(x±s)

3 討論

我們認(rèn)為DN的基本病機是氣虛無力運血而致血瘀;陰虛火旺，煎熬津液，津虧液少則血液黏稠不暢而致“陰虛血瘀”，病久不愈深伏于腎絡(luò)漸成微小癥積，致使腎體受損，腎用失司，導(dǎo)致DN的發(fā)生。據(jù)此，我們結(jié)合“病久必瘀、病久入絡(luò)”的中醫(yī)病理學(xué)理論，提出該病證病位在絡(luò)，“瘀血癥積阻于腎絡(luò)”可能是病機之關(guān)鍵，就在益氣養(yǎng)陰基礎(chǔ)上加水蛭、烏梢蛇、全蝎等化瘀消癥通絡(luò)蟲類藥物進(jìn)行干預(yù)，并對該方治療DN進(jìn)行了較為系統(tǒng)的臨床療效觀察，同時又進(jìn)行了其對TGF-β/Smads、氧化應(yīng)激及RAS系統(tǒng)等有關(guān)作用機制的基礎(chǔ)研究，均取得了滿意的治療效果〔1～6〕，進(jìn)一步證實“瘀血癥積阻絡(luò)證”幾乎貫穿DN全過程。

既往研究認(rèn)為，DN的主要病理特征是腎小球細(xì)胞外基質(zhì)堆積、系膜增寬、基底膜增厚，腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化。然而，這些因素僅能解釋30%～50%的尿蛋白排泄率和腎小球濾過率的變化〔7〕，而足細(xì)胞損傷則導(dǎo)致腎小球濾過膜完整性喪失和大量蛋白漏出〔8〕。足細(xì)胞足突間的裂孔隔膜的完整性是決定腎小球濾過屏障通透性的關(guān)鍵，而裂孔隔膜上的裂孔膜蛋白與蛋白尿的發(fā)生密切相關(guān)〔9〕。另外研究中發(fā)現(xiàn)，VEGF是迄今所發(fā)現(xiàn)最強大的血管通透因子，能增加腎小球濾過屏障對血漿蛋白的通透性。VEGF在腎臟組織中含量豐富，主要由腎小球足細(xì)胞合成分泌。糖尿病足細(xì)胞上VEGF過表達(dá)參與了尿蛋白的發(fā)生。研究也發(fā)現(xiàn)，高糖能通過如TGF-β、氧化應(yīng)激等多種因素誘導(dǎo)足細(xì)胞VEGF表達(dá)上調(diào)，VEGF還能通過VEGF受體1(Flt1)信號通路，刺激足細(xì)胞產(chǎn)生GBM的主要成分，即Ⅳ型膠原 α3 鏈〔10～12〕。Wolf等〔13〕研究表明，血管緊張素Ⅱ可以刺激足細(xì)胞產(chǎn)生VEGF，隨后引起nephrin表達(dá)的減少和蛋白尿的形成。另在DN小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，腎小球內(nèi)VEGF表達(dá)明顯增加、上皮細(xì)胞足突裂孔的密度下降，阻斷VEGF信號可部分恢復(fù)足突裂孔密度、防止腎小球基底膜增厚、減輕尿蛋白〔14〕。以上結(jié)果證明，VEGF自我調(diào)節(jié)體系在調(diào)節(jié)足細(xì)胞GBM成分中發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果表明，益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)法能夠通過對VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，發(fā)揮其延緩DN進(jìn)程的作用。結(jié)合我們以前的研究成果，綜合分析益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)法具有特定的多途徑、多靶點防治DN的細(xì)胞及分子調(diào)控機制。

1 王月華，陳志強，郭登洲，等.益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)中藥對糖尿病腎病大鼠TGF-β/Smads信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的影響〔J〕.中草藥，2009;40(4):27-30.

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