吲哚美辛預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷后炎癥反應的影響

李和平 李惠勉

(鄭州大學第二附屬醫院，河南 鄭州 450014)

腦缺血再灌注損傷的機制是一個復雜的病理級聯反應過程。尋找一種抑制再灌注損傷的腦保護藥已成為醫學界的焦點。王巖等〔1〕認為吲哚美辛對大腦有保護作用，但是作用機制臨床研究較少，本實驗通過運用大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型，觀察吲哚美辛預處理后對腦缺血再灌注損傷后腦組織海馬區中白介素IL-1β和C反應蛋白(CRP)的影響，探討其腦保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康成年雄性SD大鼠84只，體質量(300±50)g，由鄭州大學實驗動物中心提供;吲哚美辛片，由河南開封市永康藥業有限公司提供;免疫組化試劑盒購自RD公司，國內分裝。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 將大鼠隨機分為假手術組(28只)、模型組(28只)、吲哚美辛預處理組(28只)，每組于缺血后再灌注6、12、24、48 h又分為4個亞組，每組7只。

1.2.2 給藥 吲哚美辛預處理組術給予吲哚美辛水溶片(5 mg/kg)混懸液灌胃，1次/d連續3 d，根據體重計算吲哚美辛用量;假手術組和模型組均給予同等劑量生理鹽水灌胃。

1.2.3 模型制備 大鼠造模前禁食水8 h，稱重后用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術臺。根據改良Longa的線栓法，制作左側大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血再灌注模型，其成功的標準采用Longa神經功能評分法，按神經缺損輕重分為5級:神經功能正常為0級;不能伸展右側前肢為1級;向右側旋轉為2級;向右側傾倒為3級;無自主活動伴意識喪失4級。0級和4級的被淘汰，1～3級的入選實驗組，各亞組不成功者由替補組補充。

1.2.4 標本制備 模型成立后，將大鼠于各相應時間點麻醉后斷頭取腦，于4%多聚甲醛液中24 h后固定，并做組織切片，片厚約6～7μm。每組均取海馬區組織切片做HE染色，并采用免疫組織化S-P法染色且進行DAB顯色，對組織標本免疫組化結果進行定量測定，步驟按免疫組化試劑盒說明書進行。

1.3 統計學方法 數據用x±s表示，使用SPSS16.0統計軟件計算，組間比較采用單因素方差分析

2 結果

2.1 神經功能缺損評分 假手術組神經功能均正常;模型組神經功能缺損最重，各時間點缺損評分與假手術組比較有顯著性差異(P＜0.05);吲哚美辛預處理組神經功能缺失評分降低，各時間點與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)。見表1。

2.2 腦組織病理特點 大體觀察，模型組與假手術組大鼠病灶腦組織的腫脹最為明顯，而吲哚美辛預處理組與模型組相比較，腦組織水腫有不同程度的減輕。HE染色后光鏡觀察:假手術組腦海馬區神經細胞輪廓清晰，排列整齊，細胞核大且圓，著色較淺，細胞核多于細胞中央，偶可見嗜酸性核仁;模型組神經細胞輪廓模糊，排列紊亂，胞核小、著色變深，胞質分界不清;吲哚美辛預處理組神經細胞結構尚清晰，胞核與胞質尚能分清，提示吲哚美辛起到了神經保護作用。

2.3 免疫組化染色結果 IL-1β和CRP于假手術組均可見極少量陽性細胞表達，缺血再灌注6 h后兩者的表達開始增高，于24 h達高峰，48 h開始下降，各時間點與假手術組比較均明顯增高(P＜0.05);吲哚美辛預處理組各時間點與模型組相比，兩者的表達都明顯減少(P＜0.05)。見表2，表3。

表1 各組大鼠不同時間點神經功能缺失評分(x ± s，n=7)

表2 各組大鼠不同時間點CRP的表達(x ± s，n=7)

表3 各組大鼠不同時間點IL-1β的表達(x ± s，n=7)

3 討論

近年來研究認為腦缺血再灌注損傷機制主要與炎癥反應、氧自由基形成、細胞內鈣超載、興奮性氨基酸的毒性作用、一氧化氮(NO)的過多釋放、細胞凋亡等因素有關〔2〕，以上因素之間又相互聯系，并共同作用參與腦缺血再灌注損傷的過程，其中炎癥反應是腦缺血再灌注損傷發生發展十分重要的環節。

研究表明腦缺血誘導白細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞和內皮細胞等釋放炎性細胞因子如IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-8(IL-8)，黏附因子、血小板活化因子(PAF)和一些炎癥介質如前列腺素和NO等〔3〕，這些炎性因子的生成是造成缺血損傷向炎癥損傷發生的基礎，同時這些炎性因子可激活白細胞黏附到腦缺血區微血管內皮細胞上，造成內皮細胞的皺縮、壞死，破壞血-腦脊液屏障(BBB)，加重腦缺血再灌注區的損傷。此外，在腦缺血再灌注時，細胞因子IL-1β等又可以促進趨化因子和黏附因子的上調，促使白細胞與內皮細胞的黏附進一步加強，從而形成級聯炎癥反應。Vila等〔4〕研究表明IL-1β是缺血再灌注損傷后較早表達的炎癥細胞因子之一，腦缺血發生后24 h內，就可以在患者的腦脊液和血清中顯著升高，且與病情嚴重程度呈正相關。IL-1β主要存在于腦組織中，具有多方面生物學功能，在正常的腦組織中表達很少，而缺血再灌注時則明顯升高。導致損傷的機制主要為:增加興奮性氨基酸的神經毒性;增加神經細胞鈣離子超負載，加速神經細胞死亡;刺激其他多種炎癥因子及炎癥介質的釋放;誘導神經元基因的表達，促使細胞凋亡。本結果表明IL-1β在腦缺血再灌注后腦組織局部炎癥反應起關鍵作用。

臨床研究業已證明，CRP可以認為是炎癥反應等引起的急性非特異性敏感標志物，CRP水平的高低與腦缺血再灌注損傷的炎癥反應及預后呈正相關〔5，6〕。而 Mueller 等〔7〕研究表明CRP不僅直接參與炎癥反應的過程，并且可作為評估指標來反映炎癥的程度。Peps等〔8〕研究顯示在急性炎癥反應6～8 h內CRP迅速升高，可達到正常水平的幾百倍甚至更高，并在48～72 h達到高峰，隨著炎癥反應的減輕，CRP也降低。本實驗結果和其基本一致CRP可敏感地反映缺血再灌后的炎癥反應動態變化。同時Peps等〔8〕研究認為CRP導致腦缺血再灌注損傷的機制可能為:活化自身受體;激活補體系統;誘導黏附分子、單核細胞組織因子及內皮細胞的表達;激活炎性細胞因子IL-1β等的釋放。

Hartl等〔9〕認為通過干預炎癥反應的發生發展過程，就能降低腦缺血再灌注腦損傷的進程。吲哚美辛為非甾體抗炎藥，具有很強的抗炎作用，臨床主要用來治療關節炎，偏頭痛等，其作用機制為抑制環氧合酶活性而減少前列腺素的合成，抑制炎性反應，制止炎癥組織痛覺神經沖動的形成，并且抑制溶酶體酶的釋放和白細胞的趨化作用等。本實驗結果說明炎性反應參與了腦缺血再灌注損傷的病理過程;而預先給予吲哚美辛干預后，大鼠神經缺損評分減低，腦水腫減輕，IL-1β，CRP明顯降低，提示吲哚美辛具有一定腦保護作用，其機制可能是通過抑制缺血再灌注區腦組織中炎癥因子IL-1β、CRP的表達有關，為吲哚美辛治療腦缺血再灌注損傷提供理論支持。

1 王 巖，閆麗儒，呂蔓華，等.吲哚美辛對腦梗死急性期炎癥反應的影響〔J〕.中風與神經疾病雜志，2010;1227(12):1079-81.

2 夏 強，錢令波.心腦缺血再灌注損傷的機制及防治策略研究進展〔J〕.浙江大學學報:醫學版，2010;39(6):551-8.

3 Huang J，Upadhyay UM，Tamargo RJ.Inflammation in stroke and focal cerebral ischemia〔J〕.Surg Neurol，2006;66(3):232-45.

4 Vila N，Castillo J，Davalos A，et al.Proinflammatory cytokines and early neurological worsening in ischemic stroke〔J〕.Stroke，2000;31(10):2325.

5 Di Nopoli M，Di Gianfilippa G，Sollecito A，et al.C-reactive protein and outcome after first ischemic stroke〔J〕.Stroke，2000;31(1):238-9.

6 Sepulveda JL，Mehta JL.C-reactive protein and cardiovascular disease:a critical appraisal〔J〕.Curr Opin Cardial，2005;20(5):408-16.

7 Mueller C，Buettner H，Hodgon JM，et al.Inflammation and a long term mortality after non-ST elevation acute coronary syndrome treated with a very invasive strategy in 1042 consecutive patients〔J〕.Circulation，2002;105:1412.

8 Peps MB，Hirschfield GM.C-reactive protein:a critical up-date〔J〕.Clin Invest，2003;111(12):1805-12.

9 Hartl R，Schurer L，Schmid-schonbein GW，et al.Experimental antileukocyte interventions in cerebral ischemia〔J〕.Cere Blood Flow Metab，1996;16(6):1108-10.