糖尿病骨質疏松大鼠AGEs的表達及其與TGF-β1的相關性

單光宇 薛昊罡

(北華大學基礎醫學院解剖教研室，吉林 吉林 132021)

為了探討糖尿病骨質疏松大鼠晚期糖基化終末產物(AGEs)的表達情況及其與組織生長因子(TGF)-β1的相關性，本研究對比了糖尿病組大鼠與正常對照組大鼠的AGEs與TGF-β1的表達情況，探討TGF-β1在糖尿病骨質疏松保護作用中的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇24只健康的Sprague-Dawley(SD)大鼠作為研究對象，均為6月齡，雌雄各半，體重(201.54±30.24)g，購自北華大學動物實驗室，并飼養于北華大學實驗動物中心清潔級環境，所有大鼠均飼養于塑料鼠盒中，派專人看護飼養，每籠4只，共6個籠子。所有大鼠均晝夜周期12 h環境中適應性飼養2 w，并任其自由攝入標準固體顆粒飼料和自來水。

1.2 方法 隨機將SD大鼠分為正常對照組(n=12)和糖尿病組(n=12)，兩組體重、月齡及喂養條件均無明顯差異，具有可比性(P＞0.05)。其中正常對照組大鼠正常喂普通飼料和自來水，而糖尿病組大鼠則給予高糖高脂飼料喂養8 w。然后再禁食12 h后正常對照組腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液，糖尿病骨質疏松組大鼠一次性左下腹腔注射STZ 65 mg/kg。造模2 w后測定兩組大鼠的血糖和體重來鑒定糖尿病造模是否成功〔1〕，采用4%戊巴比妥鈉1 ml/kg腹腔注射麻醉下取下腔靜脈血，4℃離心，吸取上清并保存于-70℃冰箱備用〔2〕。

1.3 檢測指標 (1)血清學指標:采用Hitachi-850型熒光分光光度計測定血清中AGES的含量〔3〕。(2)骨組織中TGF-β1免疫組織化學染色:用大鼠椎體松質骨作為實驗材料，石蠟包埋、切片，脫蠟入水后3%H2O2封閉內源性過氧化氫酶，使用1∶500山羊抗大鼠 TGF-β1多克隆抗體(福建邁新，克隆號為RAB-0238)作為一抗于37℃孵育1 h，使用1∶5 000生物素化驢抗羊IgG作為二抗于37℃孵育1 h，二氨基聯苯胺(DAB)顯色。

1.4 統計學分析 計量資料以x±s表示，單因素方差分析，組間均數比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 建模情況 12只糖尿病組大鼠中1只死亡，1只建模失敗，最終糖尿病組造模成功10只。注射STZ前，糖尿病組大鼠的體重在8 w后明顯高于正常對照組，差異具有統計學意義(P＜0.05);而在注射STZ后糖尿病組大鼠的體重增長明顯緩慢，至20 w實驗結束時體重明顯低于正常對照組(P＜0.05)。注射STZ后糖尿病組大鼠的血糖較對照組大鼠明顯升高，且差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1，表2。

2.2 兩組大鼠血清AGEs水平比較 糖尿病組大鼠造模后，血清AGEs含量為(5.81±1.20)U/ml;對照組大鼠的血清AGEs含量為(1.28±3.37)U/ml，兩組比較差異具有統計學意義(t=6.57，P ＜0.05)。

2.3 兩組大鼠TGF-β1蛋白表達比較 正常對照組大鼠骨組織TGF-β1蛋白表達強且廣泛，而糖尿病組亦出現TGF-β1蛋白的陽性表達，但是糖尿病組的TGF-β1表達均散而且淡染。見圖1。將兩組的TGF-β1表達使用Image J軟件進行統計，發現糖尿病組的TGF-β1蛋白表達染色平均光密度(2.11±0.43)明顯低于對照組(4.32±0.74)，且組間比較差異有統計學意義(P ＜0.05)。

表1 注射STZ前后兩組大鼠空腹體重變化比較(x ± s，g)

表2 注射STZ前后兩組大鼠空腹血糖變化比較(x ± s，mmol/L)

2.4 大鼠血清AGEs與TGF-β1的相關性分析 血清AGEs與TGF-β1呈顯著負相關，相關系數為-0.693(P＜0.05)。

圖1 兩組大鼠骨組織的免疫組化染色(×400)

3 討論

糖尿病可引起患者多個系統損害，引起功能缺陷及衰竭〔3〕。到目前為止，糖尿病骨質疏松的發生機制和相關影響因素尚未完全明確。近年來，有學者研究發現糖尿病骨質疏松可能與AGEs引起骨代謝紊亂有關〔4～6〕。本文研究結果顯示糖尿病組大鼠造模后，糖尿病組大鼠的血清AGEs水平明顯高于對照組。這主要是由于AGEs抑制間充質干細胞(MSCs)增殖，誘導凋亡，并阻止其分化為脂肪組織、軟骨和骨組織，結果導致骨組織(如彈性膠原)理化和機械特性的改變〔7〕。另外，還有一些學者對骨質疏松與TGF-β1的關系進行了研究。有學者發現在去卵巢后6 w，大鼠骨中的TGF-β1含量即有明顯下降，認為雌激素缺乏引起的TGF-β1耗竭導致進一步的TGF-β1的分泌減少，而用生理濃度的17β-雌二醇治療可以使 TGF-β1含量上升〔8～10〕。為了探討糖尿病大鼠骨質疏松中AGEs與TGF-β1的相關性。本研究對正常對照組和糖尿病組大鼠血清中AGEs水平與骨組織TGF-β1水平進行了分析研究，結果顯示二者呈顯著負相關。這表明通過抑制AGEs而引起TGF-β1的過表達在糖尿病中起到骨保護的作用。

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