熒光PCR法對(duì)麻風(fēng)現(xiàn)癥患者與治愈者鼻分泌物麻風(fēng)桿菌檢測結(jié)果分析

蔡鑾端 鄭迪楠 鄭華生 林 旸 鄭睦暢

目前，麻風(fēng)病在我國總體處于低流行水平，但每年仍有不少新發(fā)和復(fù)發(fā)病例。迄今為止，麻風(fēng)桿菌的體外培養(yǎng)仍未成功，因此，建立檢測病原菌的方法尤為重要。熒光定量PCR是檢測麻風(fēng)桿菌的新方法。過去認(rèn)為麻風(fēng)病通過皮膚直接接觸傳播，現(xiàn)在多數(shù)學(xué)者認(rèn)為麻風(fēng)病的傳播來源主要是鼻粘膜。為了解熒光定量PCR對(duì)鼻分泌物麻風(fēng)桿菌檢測在麻風(fēng)病診治及了解聯(lián)合化療(MDT)的效果和復(fù)發(fā)方面的情況，筆者于2010年5月～2012年7月對(duì)汕頭市澄海區(qū)的5例麻風(fēng)現(xiàn)癥患者的不同時(shí)期，以及32例歷年經(jīng)聯(lián)合化療(MDT)治愈的麻風(fēng)存活者鼻分泌物進(jìn)行熒光定量PCR檢測麻風(fēng)桿菌DNA，同時(shí)與皮膚組織液同樣作PCR檢測結(jié)果作對(duì)照，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 標(biāo)本來源于5例麻風(fēng)現(xiàn)癥患者和32例歷年經(jīng)麻風(fēng)聯(lián)合化療治愈者。5例麻風(fēng)現(xiàn)癥患者中4例為多菌型（皮膚組織液抗酸染色均為陽性），1例為少菌型（抗酸染色陰性）；32例歷年存活者經(jīng)WHO推薦的麻風(fēng)聯(lián)合化療方案（多菌型方案DDS+RFP+B663三聯(lián)治療2年或治愈；少菌型方案DDS+RFP6個(gè)月～1年）治愈，其中多菌型23例，少菌型9例，已治愈5～10年7例，已治愈＞10年25例。研究組41份鼻分泌物樣本來自的5例現(xiàn)癥患者治療前和4例多菌型現(xiàn)癥患者治療半年期及32例歷年治愈者，對(duì)照組標(biāo)本取同一對(duì)象的皮膚組織液。

1.2 標(biāo)本采集和處理 （1）鼻拭子標(biāo)本：用拭子伸入被檢者鼻腔深處，緊貼鼻腔粘膜旋轉(zhuǎn)2～3周后取出，裝入拭管中冷藏；（2）皮膚組織液標(biāo)本：取被檢對(duì)象浸潤明顯的活動(dòng)性皮損或眶上、顴部、下頜和耳垂至少2個(gè)部位的皮膚組織液。常規(guī)消毒皮膚，戴消毒手套，用左手將患者皮膚捏緊提起使局部皮膚變白，右手切開一長5mm、深3mm的切口，用刀刃刮取組織液，粘于滅菌拭子放入密閉的離心管后冷藏。

1.3 麻風(fēng)桿菌DNA的提取 麻風(fēng)桿菌核酸熒光PCR檢測試劑盒是美國BioXL公司提供，按試劑盒的說明將待測標(biāo)本加生理鹽水1mL充分混勻，10000r離心5min，棄上清液，再加50μL核酸提取液B后充分混勻，100℃處理10min，10000r離心5min后，取上清液4μL做PCR反應(yīng)。

1.4 PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增儀采用廣州中山大學(xué)達(dá)安公司的DA7600全自動(dòng)基因擴(kuò)增儀,每個(gè)反應(yīng)管加入26μL試劑（MLPCR MIX 24μL+Taq酶系2μL），加入處理后DNA樣本或陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品梯度（使用前用陰性質(zhì)控品將ML-陽性標(biāo)準(zhǔn)品（1×107COPIES/mL）梯度稀釋10倍、100倍、1000倍，記為1×106COPIES/mL，1×105COPIES/mL，1×104COPIES/mL）和陰性質(zhì)控品4μL，10000r 30s。反應(yīng)條件：93℃→2min，后93℃5s→56℃ 45s，共40個(gè)循環(huán)。

1.5 結(jié)果判定 調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)曲線至最佳，儀器自動(dòng)分析計(jì)算出待測標(biāo)本數(shù)值，陰性為＜103COPIES/mL；陽性為≥103COPIES/mL（不同級(jí)別拷貝數(shù)103或104、105、106）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究組和對(duì)照組熒光PCR結(jié)果陽性率比較 41份鼻分泌物標(biāo)本經(jīng)熒光PCR檢測麻風(fēng)桿菌DNA結(jié)果陽性7份，陰性34份；對(duì)照組皮膚組織液標(biāo)本經(jīng)熒光PCR檢測麻風(fēng)桿菌DNA結(jié)果陽性8份，陰性33份，兩組檢測結(jié)果陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.082，P＞0.05），見表1。

表1 兩組標(biāo)本PCR陽性率比較

2.2 麻風(fēng)現(xiàn)癥患者熒光PCR檢測結(jié)果 麻風(fēng)現(xiàn)癥患者不同時(shí)期的9份鼻分泌物標(biāo)本（其中來自抗酸染色陽性的多菌型患者8份和抗酸染色陰性的少菌型患者1份）熒光定量PCR檢測陽性7份，陰性2份；對(duì)照組9份皮膚組織液標(biāo)本經(jīng)熒光PCR檢測麻風(fēng)桿菌DNA結(jié)果陽性8份，兩組具體拷貝數(shù)量級(jí)分布情況見表2，兩組陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 32例經(jīng)聯(lián)合化療治愈者PCR檢測結(jié)果 未發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)者，與臨床相符。32例治愈者的鼻分泌物樣本32份和皮膚組織液樣本32份做熒光定量PCR檢測麻風(fēng)桿菌DNA均為陰性。

表2 麻風(fēng)現(xiàn)癥患者熒光定量PCR檢測麻風(fēng)桿菌DNA結(jié)果

3 討論

自1981年WHO推出MDT治療麻風(fēng)病已經(jīng)實(shí)施20余年，治愈了一大批麻風(fēng)現(xiàn)癥患者。但近10年每年新發(fā)病例無明顯下降趨勢，一個(gè)重要原因是對(duì)麻風(fēng)的傳播途徑未了解透徹[1]。而多菌型患者帶菌的鼻和上呼吸道作為傳染源越來越被重視。目前涂片抗酸染色鏡檢仍是麻風(fēng)診斷和觀察療效的常規(guī)檢查方法。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展和成熟，敏感性和特異性皆高的分子生物學(xué)方法的研究應(yīng)用將提高麻風(fēng)病的早期診斷水平，阻斷其傳播，降低其新發(fā)病例。對(duì)于全球麻風(fēng)流行的控制措施尤其重要[1]。

迄今麻風(fēng)桿菌的體外培養(yǎng)仍未成功，因而建立檢測病原菌的方法尤為重要。目前PCR就成為研究麻風(fēng)分枝桿菌的理想選擇。熒光定量PCR與普通PCR的不同，其采用閉管，無需PCR后處理，避免污染和假陽性；探針與DNA特異雜交，增強(qiáng)了特異性；可定量；檢測結(jié)果由光譜分析儀自動(dòng)顯示，增強(qiáng)了靈敏性和客觀性。這種實(shí)時(shí)PCR改善了許多病原體的分子診斷，其優(yōu)點(diǎn)在于能定量檢測臨床標(biāo)本的DNA。有報(bào)道[2]此法已應(yīng)用于麻風(fēng)病臨床標(biāo)本的檢測，特別是用在常規(guī)組織學(xué)染色不能檢測到菌的標(biāo)本。Bang等[3]選擇了37例MB(多菌型）患者和32例PB(少菌型）患者進(jìn)行PCR技術(shù)和其它傳統(tǒng)方法的比較。其中MB患者的BI(細(xì)菌密度）均為陽性，而PCR的陽性率為100%，PB患者的BI均為陰性，而PCR的陽性率為50%。因此相比較于傳統(tǒng)診斷方法，對(duì)于菌量較少的患者，PCR有其優(yōu)越性。

本研究中，鼻分泌物組和皮膚組織液組檢測麻風(fēng)菌結(jié)果基本一致，陽性率很接近，表明熒光定量PCR檢測鼻分泌物麻風(fēng)桿菌DNA是可行的。另外，這種方法創(chuàng)傷小或無創(chuàng)傷，更易被患者接受。本研究PCR檢測結(jié)果同常規(guī)診斷結(jié)果基本相符。熊俊浩等[4]用麻風(fēng)分枝桿菌PCR技術(shù)，以16SrRNA作引物，對(duì)麻風(fēng)流行地區(qū)的72例經(jīng)傳統(tǒng)方法診斷的麻風(fēng)病患者和45例健康自愿受試者進(jìn)行檢測，結(jié)果與傳統(tǒng)方法診斷基本一致。

評(píng)價(jià)MDT療效的最重要的指標(biāo)是完成治療后的復(fù)發(fā)率。本研究中，檢測結(jié)果與臨床相同，未見復(fù)發(fā)；對(duì)32例皮膚組織液做熒光定量PCR檢測麻風(fēng)桿菌DNA，結(jié)果均為陰性。

從本研究中可以看出，聯(lián)合化療治療麻風(fēng)病效果好，復(fù)發(fā)少。熒光定量PCR檢測鼻分泌物麻風(fēng)桿菌DNA可做為診斷和監(jiān)測麻風(fēng)的新方法。由于病例較少，還有待進(jìn)一步研究探討。

[1]田蔚蔚.麻風(fēng)桿菌的分子生物學(xué)檢測研究進(jìn)展[J].中國麻風(fēng)皮膚病學(xué)雜志，2010，26（6）：416-418.

[2]吳勤學(xué)，宋順鵬，呂成志，等.麻風(fēng)分子生物學(xué)研究新進(jìn)展[J].中國麻風(fēng)皮膚病學(xué)雜志，2010，26（2）：121-122.

[3]Bang PD,Suzuki k,phuong LT,et al.Evaluation of Polymerase Chain reaction-based detection of Mycobacterium Leprae for the diagnosic of leprosy[J].J Dermatol,2009,36（6）：269-276.

[4]熊俊浩，雍剛，喻林沖.多聚酶鏈技術(shù)在麻風(fēng)診斷中的應(yīng)用研究[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志，2001，17（2)：68-69.