生存素反義寡核苷酸對人胃癌細胞移植瘤作用及原理探討

王超群 孔慶兗

生存素（Survivin）是細胞內凋亡抑制蛋白家族成員，能夠促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。研究表明，生存素在胃癌等腫瘤細胞中高表達，應用反義策略阻斷生存素表達在體外可明顯抑制胃癌細胞的生長[1]。本文研究探討生存素反義寡核苷酸對人胃癌裸鼠移植瘤的作用，并探討其與轉錄激活因子STAT-3的關系。

1 資料與方法

1.1 主要試劑 人胃癌細胞系HS2746T（武漢大學培養物保存中心）；兔抗人STAT-3單克隆抗體（美國CST公司）；兔抗人Survivin多克隆抗體（福州邁新公司）；PV-9000通用型二步法免疫組化檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司）。生存素正、反義寡核苷酸由上海博亞生物工程有限公司合成與純化。

1.2 實驗動物 BALB/C nu/nu裸小鼠30只，雌雄各半，4～6周齡，體重20～22g，由同濟醫學院實驗動物中心提供。

1.3 人胃癌細胞的培養與裸鼠胃癌模型的建立[2]將 人胃癌細胞系HS2746T置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養液常規培養。

取對數生長期的人胃癌細胞HS2746T，稀釋為濃度為315×105/mL的細胞懸液，取0.2mL細胞懸液接種于裸鼠的背部左后肢處，以皮下結節直徑超過0.5cm作為成瘤標準，接種后觀察注射點無破潰紅腫，2周左右成瘤，成瘤率為100%。

1.4 實驗分組與處理 將30只成瘤裸鼠按隨機數字表法分成5組，即空白對照組、SODN對照組和100、200、400nmol/L 3種濃度的ASODN組。各組于接種后15d開始第一次注射，并于第一次注射后2d、4d、8d、12d、16d、20d體內多點注射相應試劑0.2mL。

每次注射前用游標卡尺測量移植瘤體積，并記錄裸鼠體重。20d后斷頸處死裸鼠，取腫瘤稱重并計算抑瘤率和腫瘤縮小率。腫瘤體積計算公式為：V(mm3)=[π×瘤體最長徑(a)×最短徑(b)2]/6；抑瘤率計算公式為：（對照組平均瘤重-治療組平均瘤重）/對照組平均瘤重×100%；腫瘤縮小率計算公式為：（注射前體積-注射后體積）/治療前體積×100%。

1.5 免疫組化二步法檢測STAT-3蛋白的表達 取所有裸鼠皮下移植瘤，經10%福爾馬林固定后常規石蠟包埋，制成4μm厚的切片，免疫組化二步法操作步驟參照PV-9000通用型二步法免疫組化檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒的產品說明書進行，并以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.6 統計學方法 采用SPSS 13.0統計學軟件處理數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生存素反義寡核苷酸對人胃癌細胞移植瘤的作用 所有裸鼠在接種人胃癌細胞懸液后均存活并形成腫瘤，接種點無破潰紅腫，成瘤時間為（13.0±2）d，接種15d后移植瘤為（72.1±8.5）mm3，比較各組平均數，均無統計學差異，具有可比性。在第一次注射后2d、4d、8d、12d、16d、20d，空白對照組及SODN對照組在腫瘤體積、抑瘤率及腫瘤縮小率等方面的差異均無統計學意義（P＞0.05）。100、200、400nmol/L 3種濃度的ASODN組在第一次注射后4d～8d，腫瘤體積明顯小于空白對照組及SODN對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），腫瘤縮小率明顯高于空白對照組及SODN對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。比較3個不同濃度的ASODN組發現，隨著給藥濃度和時間的增加，裸鼠移植瘤的體積減小而腫瘤縮小率增大，呈時間和劑量依賴性。裸鼠處死后測定抑瘤率，3個不同濃度的ASODN組明顯大于空白對照組及SODN對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），且400nmol/L ASODN組的抑瘤率最大達到84%。不同處理組對人胃癌細胞移植瘤的抑制作用見表1。

2.2 生存素反義寡核苷酸與轉錄激活因子STAT-3的關系

空白對照組及SODN對照組移植瘤中的STAT-3蛋白表達水平的差異無統計學意義（P＞0.05）；與空白對照組比較，第一次注射后4～8d，3個不同濃度的ASODN組移植瘤中的STAT-3蛋白表達水平明顯提高（P＜0.05），且呈濃度和時間依賴性。

表1 不同處理組對人胃癌細胞移植瘤的抑制作用

3 討論

生存素在機體細胞中的表達具有非常嚴格的細胞周期性，尤其在G2/M期可以特異性的表達，此外生存素的表達具有高度特異性，可以在大多數腫瘤組織和胚胎發育組織中表達，但是在正常人的終末分化組織中是不表達的。應用反義策略阻斷生存素表達抑制癌細胞的生長是治療癌癥的新思路。

生存素與胃癌的形成和發展關系密切，是早期發現胃癌的良好標志物，也是判斷預后的較佳指標。本研究成功建立了人胃癌細胞皮下移植瘤模型，研究結果表明，空白對照組及SODN對照組對皮下移植瘤無明顯抑制作用，而3個不同濃度的ASODN組對皮下移植瘤均具有一定的抑制作用，且呈時間和劑量依賴性，提示生成素ASODN能夠有效抑制移植瘤的生長。這與國外報道的生存素具有抑制腫瘤生長的報道是一致的，此外，本研究還探討了生成素ASODN與轉錄激活因子STAT-3的關系，結果表明，隨著生成素ASODN濃度的增加，移植瘤中的STAT-3蛋白表達水平明顯提高，呈正相關。有文獻報道，生成素可能是STAT-3信號通路的一個下游靶基因[3]。通過注射生成素ASODN降低了生成素表達，通過負反饋調節，從而增加轉錄激活因子STAT-3的表達。

[1]付廣,王國斌,盧曉明,等.生存素反義寡核苷酸對胃癌細胞的抑制作用[J].中華實驗外科雜志,2005,22(9)：1084-1086.

[2]付廣,王國斌,盧曉明,等.脂質體生存素反義寡核苷酸抑制胃癌裸鼠皮下移植瘤生長的作用[J].中華實驗外科雜志,2004,42(22)：1367-1371.

[3]張建國,趙晶,李遠航,等.STAT3、p-STAT3與Survivin在胃癌及其癌前病變組織中的表達及意義[J].中國醫科大學學報,2009,38(12)：907-912.