脂血和溶血對HBV DNA 實時熒光定量PCR 檢測的影響

張翠莉，劉 萍，魏文波

臨床標本不僅種類多樣，如血清、血漿、膿液、腦脊液、痰、分泌物等，并且同類型標本也可有不同的性質，如血清標本會有不同程度的溶血、脂血標本等。筆者利用實時熒光定量PCR 方法檢測不同程度脂血、溶血標本中乙肝病毒脫氧核糖核酸(HBV DNA)的結果，并進行統計學分析，以研究脂血、溶血是否影響熒光定量PCR 擴增HBV DNA 結果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 熒光定量PCR 儀(型號:DA7600，中山大學達安基因股份有限公司);HBV DNA 試劑(達安基因有限公司，批號2010004);日立7180 全自動生化儀;紫外可見分光光度計;三酰甘油(triglyceride，TG)生化試劑(浙江伊利康生物技術有限公司，批號為20100105)。

1.2 標本采集

1.2.1 研究乳糜狀脂血因素實驗的標本收集 收集武警四川總隊醫院2010－04 至2010－05 血脂正常、無溶血的HBV DNA 血標本共30 例，每例采集血液3 ml。根據HBV DNA 濃度將所收集的30 例標本分為兩個水平:中高HBV DNA 濃度，即HBV DNA≥1.0 ×105標本15 例，設定為Ⅰ水平;HBV DNA 臨界濃度1.0 ×103至1.0 ×104標本15 例，設定為Ⅱ水平。收集乙肝表面抗體(HBsAb)陽性或兩對半全陰性、肝功能正常、無溶血的重度乳糜狀脂血標本及正常人血清標本各5 例，每例采集血液3 ml，及時分離血清，－20 ℃保存。

1.2.2 研究溶血因素實驗的標本收集 收集臨床乙肝患者無脂血、無黃疸血標本30 例，每人同時采集3 管，每管3 ml，其中兩管－20 ℃冷凍不同時間致不同程度溶血［1］，留做平行實驗。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計 設計不同血脂(三酰甘油)濃度和不同溶血程度的標本，并研究兩種因素對熒光定量PCR 測定兩個水平HBV DNA 結果是否有影響。

1.3.2 標本制作

1.3.2.1 兩種水平HBV DNA 不同TG 濃度標本的制作 (1)按照HBV DNA 濃度將臨床收集的標本分為兩個水平，分別為中高濃度HBV DNA≥1.0×10515 份(Ⅰ水平);臨界濃度，HBV DNA 介于1.0 ×103～1.0 ×10415 份(Ⅱ水平)。(2)按照美國國家膽固醇教育計劃的成人治療專家組Ⅲ(NCEPATP Ⅲ)血脂標準，結合本實驗，制作3 種TG 濃度梯度標本，極高TG 濃度脂血(TG≥5.64 mmol/L，A組)、高TG 濃度(TG 2.26 ～5.63 mmol/L，B 組)及正常血脂濃度標本(C 組)。(3)將所收集的重度乳糜狀的脂血標本混勻，進行TG 檢測，TG 為13.88 mmol/L;(4)HBV DNAⅠ水平不同濃度TG 標本的制作:AⅠ組:重度乳糜狀標本∶正常人血清∶HBV DNAⅠ水平 =1∶0∶1。BⅠ組:重度乳糜狀標本∶正常人血清:HBV DNAⅠ水平 =0.5∶0.5∶1。CⅠ組:重度乳糜狀標本∶正常人血清∶HBV DNAⅠ水平 =0∶1∶1。(5)HBV DNAⅡ水平不同濃度TG 標本的制作:AⅡ組:重度乳糜狀標本∶正常人血清∶HBV DNAⅡ水平 =1∶0∶1。BⅡ組:重度乳糜狀標本∶正常人血清∶HBV DNAⅡ水平=0.5∶0.5∶1。CⅡ組:重度乳糜狀標本∶正常人血清∶HBV DNAⅡ水平 =0∶1∶1。

1.3.2.2 兩種水平HBV DNA 不同溶血程度標本制作 采用－20 ℃冰箱冷凍不同時間，導致標本不同程度溶血，利用分光光度計氰化高鐵血紅蛋白測定法，檢測血紅蛋白濃度，從而將溶血標本分為重度溶血組(血紅蛋白＞5.0 g/L，D 組)、輕中度溶血組(0.8g/L ＜血紅蛋白＜5.0 g/L，E 組)［1］、無溶血組(F 組)。(1)HBV DNAⅠ水平3 種溶血標本，即:DⅠ組、EⅠ組、FⅠ組;(2)HBV DNAⅡ水平3 種溶血標本，即:DⅡ組、EⅡ組、FⅡ組。

1.3.3 HBV DNA 提取和檢測 參照達安基因公司試劑盒說明書進行，待測標本與室內質控標本同時進行檢測。

1.4 統計學處理 采用SPSS13.0 軟件對數據進行統計學分析，對三組標本PCR 結果取對數(Log10)進行數據轉換，其結果符合正態分布，對三組數據進行方差齊性檢驗，結果方差齊同。對三組數據進行F 檢驗。

2 結果

2.1 不同TG 濃度對HBV DNA 實時熒光定量PCR結果的影響 ABC 三組不同TG 濃度對HBV DNAⅠ、Ⅱ水平實時熒光定量PCR 擴增結果均無影響(P ＞0.05，表1)。

表1 不同TG 濃度對HBV DNA 熒光定量擴增結果的影響(±s，U/ml)

表1 不同TG 濃度對HBV DNA 熒光定量擴增結果的影響(±s，U/ml)

分組例數(n)HBV DNA 水平組ⅠⅡA156.26±0.913.12±0.71 B156.28±0.882.98±0.80 C156.57±0.983.09±0.69

2.2 不同溶血程度對HBV DNA 實時熒光定量PCR 結果的影響 在HBV DNAⅠ水平和Ⅱ水平中，不同程度的溶血對PCR 擴增結果均無影響(P ＞0.05，表2)。

表2 不同程度溶血對HBV DNA 熒光定量擴增結果的影響(±s，U/ml)

表2 不同程度溶血對HBV DNA 熒光定量擴增結果的影響(±s，U/ml)

分組例數(n)HBV DNA 水平組ⅠⅡD156.13±0.893.35±0.80 E156.21±0.913.48±0.75 F156.17±0.933.43±0.78

3 討論

PCR 技術由于其極高的檢測靈敏度和特異性，在臨床疾病診斷和療效觀察上得到了廣泛的應用，大大提高了疾病診斷的準確性和快速性。熒光定量PCR 所采用的UNG 防污染技術和熒光探針標記閉管檢測技術也有效控制了假陽性的發生。盡管如此，由于臨床標本的多樣性，比如溶血、脂血、藥物等因素的存在，可能造成熒光定量PCR 檢測結果假陰性發生。有研究表明，溶血標本因其血紅素及代謝產物的殘留抑制了DNA 聚合酶，會降低熒光定量PCR 結果，甚至出現假陰性［2，3］。黃其俊和吳堅敏［4］的研究表明，溶血程度不同對HBV DNA 定量結果的影響不同，即Hb ＞5.0 g/L 的重度溶血標本會導致HBV DNA 熒光定量PCR 檢測結果降低，而輕度溶血標本對HBV DNA 實時熒光定量結果的影響無顯著性差異。對于脂血是否影響熒光定量PCR 檢測結果的研究也存在矛盾之處。文獻［5，6］認為，脂血會降低HBV DNA 檢測結果，并且隨著TG 水平的增高，對HBV DNA 結果影響越大。李小寧等［7］研究表明，高TG 乳糜狀血清不會對HBV DNA≥1.0 ×105的檢測結果產生影響。

本研究結果表明，無論溶血程度如何，無論HBV DNA 濃度如何，溶血對HBV DNA 實時熒光定量PCR 檢測結果的影響都無顯著性差異，且高血脂不僅不會影響中高濃度HBV DNA 檢測結果，對臨界濃度HBV DNA 結果的影響差異亦無統計學意義(P ＞0.05)。本研究還對HBV DNA 濃度＜1.0 ×103的標本進行了脂血和溶血因素的研究，檢測結果也100%符合，表明脂血和溶血不會導致假陽性結果產生。

本實驗在提取核酸過程中，血紅蛋白能被有效地去除，故得出了血紅蛋白對熒光定量PCR 檢測HBV DNA 沒有差異性影響的結果，不同的血脂濃度對檢測結果的影響差異也無統計學意義(P ＞0.05)。對于與黃其俊等［4］研究結果的矛盾，可能是由于實驗設計和統計學處理的不同所導致。本研究設計的各溶血組(D、E 組)與對照組(F)均采用同一患者同時采集的樣本進行，使得整個實驗更具有可比性，結果更具有說服力。在脂血是否影響實時熒光定量PCR 檢測HBV DNA 研究上，本研究結果與高峰等［5］的研究結果有差異，分析其原因可能是:(1)試劑靈敏度和特異性的差異;(2)統計學分析時所采用的標準及方法不同所造成。實驗本研究結果在同李小寧等［7］研究結果一致的同時，本研究還從HBV DNA 臨界值水平進行了脂血對熒光定量PCR 方法是否具有影響的研究。從本研究所得出的結論可以看出，高血脂乳糜狀標本不會影響熒光定量PCR 方法檢測HBV DNA。

［1］ 董振南，高 靜. 不同程度溶血對常規生化檢驗結果影響的探討［J］. 軍醫進修學院學報，2005，26 (5):329－331.

［2］ Akane A，Matsubara K，Nakamura H，et al. Identification of the heme compound copurified with deoxyribonucleic acid(DNA)from Bloodstains，a major inhibitor of polymerase chain reaction(PCR)amplification［J］. J Forensic Sci，1994，39(2):362－372.

［3］ 陳英劍，胡成進，齊發蓮，等. 溶血對熒光定量PCR檢測HBV DNA 結果的影響［J］. 國外醫學臨床生化與檢驗學分冊，2004，25(6):563－564.

［4］ 黃其俊，吳堅敏. 不同程度溶血對熒光定量PCR 檢測HBV DNA 結果的影響［J］. 實驗與檢驗醫學，2008，26 (2):211－213.

［5］ 高 峰，高慧華，楊學文. 脂血因素對熒光定量PCR檢測乙肝病毒DNA 的影響及解決措施［J］. 臨床檢驗雜志，2007，25(5):359－360.

［6］ 朱艷華，張慧敏. 脂血對檢測HBV DNA 的影響及解決辦法［J］. 內蒙古醫學雜志，2009，10:1214－1215.

［7］ 李小寧，黃升海. 脂血標本對HBV DNA 定量檢測結果的影響［J］. 皖南醫學院學報，2007，26(4):285－286.