皂角刺總黃酮的含量測定＊

陳海霞 田吉 肖順漢△

（1.瀘州醫學院藥理學教研室，四川 瀘州646000；2.瀘州醫學院藥物與功能性食品研究中心，四川 瀘州646000）

皂角刺（Spina Gleditsiae），為豆科植物皂莢Gleditsia sinensis Lam.的干燥棘刺，始載于《本草綱目》，已被列為抗癌中草藥之一。中藥化學成分含黃酮、皂苷、三萜、氨基酸等，能夠增強機體免疫力，具有抗癌作用的部分主要是黃酮類化合物［1－2］。總黃酮含量測定的方法［3－4］主要有紫外可見分光光度法：測定含量時，樣品中加入顯色劑生成有色金屬絡合物，作用在光譜上能出現明顯的吸收峰，這種紫外可見分光光度的方法又稱為比色法。薄層掃描法是在樣品經薄層分離后，在特定波長下用光度計直接測定其吸光度。隨著科技的發展，還有其他如制備高效液相色譜法、熒光分光光度法、毛細管電泳法等廣泛用于黃酮的含量測定。本文在參考諸多文獻的基礎上，結合現有條件，利用比色法測定皂角刺總黃酮含量，為評價黃酮類及其制品的質量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥材與樣品

皂角刺干藥材購于瀘州百草堂飲片公司，由瀘州醫學院生藥教研室稅丕先老師鑒定。皂角刺總黃酮粗提物：取12kg皂角刺干藥材，用粉碎機充分粉碎，打粉（20－30目），以8倍量（m∶v＝1∶8，g·mL－1）的50%乙醇加熱回流提取兩次［5－6］，每次1h，合并回流液并減壓濃縮，回收乙醇溶劑，減壓干燥，得0.48kg皂角刺干浸膏，放入干燥器緩慢烘干備用。皂角刺總黃酮純化物：皂角刺總黃酮粗提物經聚酰胺純化工藝獲得。

1.2 試劑與儀器

蘆丁對照品 （Purity≥98%，成都曼斯特生物有限公司），水為本院藥研所自制純凈水。乙醇，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉等均為分析純。電子天平 （FA1604N，0.1mg，上海民橋精密科學儀器有限公司），紫外分光光度計（UV－2100，北京瑞利分析儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液的制備

精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁對照品5.3mg，至25 mL容量瓶中，加50%乙醇溶解，搖勻定容至刻度，即得濃度為0.21mg·mL－1的對照品溶液。

1.3.2 樣品溶液的制備

（1）精密稱取皂角刺總黃酮粗提細粉0.1076g至25mL容量瓶中，加50%乙醇溶解，搖勻定容至刻度，即得濃度為4.2mg·mL－1的樣品溶液。（2）精密稱取皂角刺總黃酮純化細粉0.0463g至10mL容量瓶中，加50%乙醇溶解，搖勻定容至刻度，即得濃度為4.6mg·mL－1的樣品溶液。

1.3.3 檢測波長的選擇

精密吸取蘆丁對照品溶液3mL，至10mL具塞試管中，加入5%的NaNO2溶液0.3mL，搖勻后放置6min，加入10%的Al（NO3）3溶液0.3mL，搖勻后放置6min，再加入1moL·L－1NaOH溶液4mL，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15min。置于比色皿中，以試劑空白作為參比［7］，照分光光度法，在200～900nm波長的范圍內掃描，選擇吸光度值最大時的波長為蘆丁對照品的最大特征吸收波長。

1.3.4 標準曲線的繪制

精密 吸 取 蘆 丁 對 照 品 液 0、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL，分別置于10mL具塞試管中，加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁試液0.3mL，搖勻，放置6min，加1moL·L－1氫氧化鈉試液4mL，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15min，以第一份作為空白，于510nm波長處測定吸光度。

1.3.5 精密度試驗

取同一供試品溶液5份，每份精密吸取0.2mL，照標準曲線項下方法測定含量。

1.3.6 穩定性試驗

［8］，精密吸取同一供試品溶液，照標準曲線項下方法，每隔10min測定一次吸光度A值，連續測定至第60 min。

1.3.7 重復性試驗

取同一皂角刺總黃酮樣品5份，每份0.1076g，精密稱定，照標準曲線項下方法測定含量。

1.3.8 加樣回收率試驗

精密稱取樣品（總黃酮粗提物，含量為58.84%）0.0538g，6份，編號1～6，1、2號（按樣品黃酮含量∶對照品＝1∶0.8）加入蘆丁對照品25.33mg，3、4號（按樣品黃酮含量∶對照品＝1∶1）加入蘆丁對照品31.66mg，5、6號（按樣品黃酮含量∶對照品＝1∶1.2）加入蘆丁對照品37.99mg。依法制備供試品溶液，并按含量測定項下方法測定，按公式計算回收率，回收率＝（實測黃酮含量－樣品中黃酮含量）／黃酮對照品加入量×100%。

1.3.9 樣品含量測定

精密吸取皂角刺總黃酮粗提物溶液0.2mL，置于10mL具塞試管中，加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁試液0.3mL，搖勻，放置6min，加1moL·L－1氫氧化鈉試液4mL，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15min。置于比色皿中，以試劑空白作為參比，照分光光度法，于510nm波長處測定吸光度值。根據標準曲線方程及計算公式，計算出皂角刺總黃酮粗提物的含量。

按上述方法，精密吸取皂角刺總黃酮純化物溶液0.1mL，于510nm波長處測定吸光度值，根據標準曲線方程及計算公式，計算出皂角刺總黃酮純化后的含量。黃酮含量（%）＝（測出質量／取樣體積×供試品總體積）／供試樣品總質量×100%

2 結果

2.1 檢測波長的確定

總黃酮樣品溶液和對照品溶液顯色后兩者的峰型相似，在510nm處均有一個強吸收峰，結果表明，蘆丁對照品在510nm處有最大吸收峰，故將510nm作為總黃酮的檢測波長，見圖1。

圖1 蘆丁標準品和總黃酮樣品溶液吸收光譜

2.2 線性關系考察

以蘆丁為標準品，顯色測定以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，用最小二乘法得出回歸方程為y＝1.1939x－0.0068，r＝0.9999，表明樣品濃度在0.053～0.848 mg范圍內與吸光度線性關系良好，見圖2。

圖2 蘆丁標準曲線

2.3 精密度試驗

由表1可知，五次測定吸收度的平均值為0.4455，每個樣品測定的A值變化很小，相對標準偏差（RSD）為0.11%，表明儀器的精密度良好。RSD%＝S／X×100%，其中S為標準偏差，X為測量平均值。

表1 精密度試驗

2.4 穩定性試驗

實驗表明在30min內吸收度（A）值保持穩定，60min后吸收度（A）值下降約9%，因此顯色后應在30min內測定吸光度。

表2 穩定性試驗

2.5 重復性試驗

由表3可知，平均含量為58.50%，RSD為2.40%，表明本品重復性良好。

表3 重復性試驗

2.6 加樣回收試驗

從表4可見，總黃酮平均回收率為96.7%，RSD為2.02%（＜3%），表明該方法不存在系統誤差，可以作為皂角刺總黃酮含量的測定方法。

表4 加樣回收試驗

2.7 樣品含量測定

由表5可見，經聚酰胺柱二次吸附、洗脫后，總黃酮含量從58.84%提高到了81.84%。

表5 皂角刺總黃酮含量測定

3 討論

黃酮類物質是廣泛存在于植物中的一類黃色素，在氧化劑亞硝酸鹽存在的情況下，與硝酸鋁生成黃色的黃酮鋁絡合物，遇堿呈紅色，在可見光內出現穩定的吸收峰［9］，故本實驗用紫外可見分光光度法（比色法）［10，11］測定皂角刺總黃酮含量。該法具有設備簡單、適用性廣、準確度和精密度較好等特點，在中藥總黃酮含量分析中發揮著重要作用。在實際生產和科研過程中，高效液相色譜法（HPLC）適用于黃酮單體含量的測定，靈敏度高，但儀器價格昂貴；薄層掃描法操作麻煩，可行性差。

在對總黃酮比色法含量測定過程中，注意消除顯色劑或供試液本身顏色可能存在的干擾。如果制得的待測液有不溶物析出，應考慮改變溶媒的比例或離心，使待測液澄明，以保證測得的吸收度值穩定［12］。

本實驗中所采用的標準品蘆丁只是一種典型的黃酮類化合物，并不能代表皂角刺中的黃酮類化合物，但由于它與皂角刺中的黃酮類化合物在分別經顏色反應后，于510nm處均有最大值，因此可以利用其顏色反應在可見分光光度計下繪制標準工作曲線，以測定總黃酮含量。今后可嘗試以皂角刺中有代表性的黃酮類化合物如槲皮素等為標準品，利用HPLC對皂角刺總黃酮進行定量分析。

參考文獻

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