CerbB-2蛋白在胃癌組織中的表達及臨床意義

王龍躍，連 婧，段偉宏，朱震宇，周寧新

(1.山西醫科大學，山西 太原 030001;2.山西省腫瘤醫院，山西太原 030013;3.解放軍第二炮兵總醫院肝膽胃腸病研究所，北京100088)

胃癌是我國常見的消化系統惡性腫瘤，有一些病例，臨床確診較晚，預后較差。治療方式仍以外科手術為主，早期胃癌可以通過手術治愈，但多數胃癌患者確診時已到中晚期。盡管聯合圍術期化療或術后輔助化療治療，但進展期胃癌生存率仍很低。隨著CerbB-2基因與乳腺癌靶向治療取得的顯著成果，關于CerbB-2基因與胃癌之間的關系，也被人們進一步關注和研究。

CerbB-2基因亦稱HER2基因。HER2基因是表皮生長因子受體家族成員之一，其表達的蛋白產物為人表皮生長因子受體2，基因定位于染色體17q21，編碼相對分子質量為185 000的跨膜酪氨酸激酶受體，即CerbB-2蛋白。正常情況下該基因處于非激活狀態，參與組織細胞生長發育的調節。當受體內外環境因素刺激的作用下，其結構和表達調控失常，造成細胞增殖，促進細胞惡性轉化，與腫瘤的發生發展密切相關［1］。現有研究發現，人類多種腫瘤組織中都有不同比例的CerbB-2基因的表達和擴增。CerbB-2過表達常見于乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌等，與腫瘤的侵襲、轉移、化療耐藥及預后不良有明顯的相關性［2］。CerbB-2的檢測方法包括免疫組織化學染色(immunohistochemistry，IHC)和原位雜交(in situ hybridization)技術，后者包括熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)和雙色銀染原位雜交(dual chromogen visualization with silver in situ hybridization，DSISH)。本文采用組織病理學、免疫組織化學方法，研究CerbB-2蛋白在胃癌組織中的表達，探討其表達及腫瘤臨床病理特點和生物學行為關系，為個體化治療CerbB-2陽性胃癌患者制定方案提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 資料

選取2012年4月至2012年7月在山西省腫瘤醫院行胃癌外科手術治療的病理標本118例。病例入選標準:a)病歷及手術后病理學資料完整者;b)排除胃的其他惡性腫瘤如淋巴瘤、平滑肌肉瘤等;c)排除合并其他原發惡性腫瘤，如結直腸癌等;d)術前未行任何輔助化療或免疫治療。所有標本經10%甲醛固定，常規取材，石蠟包埋，并經HE染色確診。

按照2003年WHO消化系統腫瘤病理學和遺傳學中胃癌組織學分類標準將進展期胃癌分為腺癌、乳頭狀腺癌、管狀腺癌、黏液腺癌和印戒細胞癌等。根據Lauren胃癌分型將胃癌分為腸型(intestinal type)和彌漫型胃癌(diffuse type)兩類。按美國癌癥聯合委員會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)胃癌TNM分期標準(第7版)進行TNM分期評估和臨床分期評估。

1.2 方法

組織處理使用10%中性緩沖甲醛液作為固定劑，組織離體后盡快固定，最遲不超過1 h，固定時間為6～48 h，石蠟包埋，制備4 μm厚連續切片，首先脫蠟5 min，共5 次;抗原修復，pH6.0，37 ℃，30 min;滴加一抗，37℃，32 min;滴加二抗，37℃，30 min;DAB顯色8 min;蘇木精復染細胞核;常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

抗體選擇，一抗為C－erbB-2，二抗為抗一抗體(美國Invitrogen/Zymed公司生產)。

1.3 免疫組化結果判定

手術標本染色形態，無反應或＜10%的腫瘤細胞出現細胞膜反應，分值為0。大于等于10%的腫瘤細胞出現微弱或難以察覺的細胞膜反應;細胞的部分細胞膜有反應，分值為1+。大于等于10%的腫瘤細胞出現微弱至中等強度的完整、基底側或側膜反應，分值為2+。大于等于10%的腫瘤細胞中出現高強度的完整、基底外側或側膜反應 ，分值為3+［3］。CerbB-2為細胞胞膜、細胞質著色呈棕黃色顆粒，0分和(1+)為陰性;陽性為(2+)～(3+)。CerbB-2在胃癌組織中的不同表達結果見圖1。

圖1 CerbB-2在胃癌組織中的不同表達結果Fig 1 Different Expression Results of CerbB-2 in Gastric Cancer Tissue

1.4 統計學方法

采用SPSS13.0統計軟件進行統計分析，計數資料采用χ2檢驗進行CerbB-2狀態分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床及病理情況

118例胃癌中男性87例，女性31例，男女比例為2.8∶1。中位年齡60歲(32～83歲)，其中57例患者＜60歲，61例患者≥60歲。所有患者術前均經胃鏡活檢病理學證實為原發性胃癌。其中手術方式以D2根治術者101例，姑息性切除術者17例;腫瘤位于食管胃連接部者70例，胃體者19例，胃竇部者29例;腫瘤最大直徑≤5 cm者66例，＞5 cm者52例;病理類型中高分化者47例，低分化者71例;遠處轉移17例;切緣陽性2例;腫瘤侵犯神經73例，腫瘤侵犯脈管87例，腫瘤侵犯食道下段27例。臨床分期:Ⅰ～Ⅱ期25例(其中Ⅰ期5例，Ⅱ期20例)，Ⅲ～Ⅳ期93例(其中Ⅲ期 76例，Ⅳ期17例);其中陽性表達腸型胃癌18例，彌漫型胃癌7例，中高分化胃癌18例，低分化胃癌11例。胃癌組織中CerbB-2表達與臨床病理參數的相關性分析見表1。

表1 胃癌組織中CerbB-2表達與臨床病理參數的相關性分析 例Table 1 Analysis of Relevance to CerbB-2 Expression and Clinicopathologic Parameters in Gastric Cancer Tissue case

2.2 免疫組化結果

在118例胃癌中，CerbB-2免疫組織化學標記(0)者49例，免疫組織化學標記(1+)者40例，免疫組織化學標記可疑(2+)者21例，免疫組織化學標記(3+)者8例，其中免疫組織化學標記(3+)和免疫組織化學標記可疑(2+)者共29例，CerbB-2陽性表達率24.6%。

2.3 統計結果

CerbB-2表達與病理類型、Lauren分型、脈管侵犯和神經侵犯有關(P＜0.05)。腸型胃癌的表達率(38.3%)明顯高于彌漫型胃癌(18.4%，P ＜ 0.05)。CerbB-2蛋白表達與患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤侵襲深度、TNM分期無關。

3 討論

1986年日本學者K.Sakai首次利用免疫組化方法(immunohisto-chemistry，IHC)發現胃癌中 CerbB-2的過表達［4］。隨后越來越多的研究報道胃癌中存在CerbB-2 過表達，但表達率不盡相同，有報道［5～9］約6.8% ～34.0%的胃癌有CerbB-2過表達或擴增。其差異率可能是由于樣本數量、檢測方法、評分標準的不同而產生差異性。本資料的結果顯示其陽性率為24.6%，位于其范圍之內。

CerbB-2在胃癌組織中的表達能否為胃癌靶向治療藥物的選擇提供理論依據，是近年來的研究熱點。在1項203例胃癌 CerbB-2表達情況的前瞻性研究中，Ailgayer等［10］發現 CerbB-2陽性的病例其無病生存期和整體生存期更低，提示CerbB-2與根治性切除、腫瘤TNM分期等均是影響胃癌患者整體生存期的獨立因素;Tanner等［6］研究調查了131例胃癌患者的生存期，發現CerbB-2陽性患者中位生存期僅為6.6個月，相比CerbB-2陰性患者中位生存期明顯縮短(12.7個月)，但無統計學差異(P=0.37)，可能與樣本量有關，另外還有報道分析了182例手術治療后胃癌患者CerbB-2基因表達情況，發現CerbB-2陽性的胃癌患者預后差、且5年生存率較低，多變量分析結果顯示年齡、TNM分期和CerbB-2基因擴增均是影響生存期相對獨立因素［11］。總之，越來越多的研究提示胃癌CerbB-2表達與胃癌預后存在相關性，可以作為評估胃癌預后的獨立因子。

1965年芬蘭人Lauren按照組織發生學將胃癌分為腸型和彌漫型(胃型)兩類，通常認為腸型胃癌常見于老年人，細胞分化程度一般較高。C.Gravalos等［7］對166例胃癌組織標本進行研究，發現CerbB-2陽性率為腸型16%，彌漫型7%，具有統計學差異;而在最近的ToGA試驗中，CerbB-2陽性率與胃癌組織分型差異顯著，其中腸型36%，彌漫型6%，混合型10%［12］。本資料結果顯示，腸型胃癌與彌漫型胃癌CerbB-2陽性率分別為38.3%和18.4%，(P ＜0.05)，具有統計學差異，這與國外的研究一致。高中分化型胃癌 CerbB-2陽性率高于低分化型胃癌CerbB-2陽性率分別為38.3%和15.5%，(P ＜0.05)。這與 Lauren 分型相符合是因為高中分化癌多為腸型胃癌，低分化癌包括印戒細胞癌多為彌漫型胃癌，同樣提示了胃癌CerbB-2基因的擴增和蛋白表達具有選擇性。國外有關研究表明［13］，就淋巴結轉移率、腫瘤浸潤深度相比較，CerbB-2陽性比CerbB-2陰性的高中分化胃癌均高，提示CerbB-2表達可能影響胃癌預后。

國外有研究顯示，CerbB-2表達在胃癌原發部位具有相關性，尤其是在胃食管結合部(gastroesphageal，GEJ)癌存在更高表達。還有結果表明，GEJ癌相比胃部癌存在更高的CerbB-2陽性表達，表達率25%～36%［14］，C.Gravalos等［7］研究提示了胃食管連接部癌CerbB-2陽性率為25%，其他部位胃癌CerbB-2陽性率9.5%，具有統計學意義;Tanner等［6］研究也表明 GEJ癌CerbB-2基因擴增明顯高于其他部位胃癌;ToGA試驗中報道1 580胃癌患者中，GEJ癌 CerbB-2陽性率32%，而其他部位胃癌CerbB-2陽性率18%［12］。這些結果間接提示針對CerbB-2陽性表達患者治療對于GEJ癌患者受益范圍更大。

但在本資料結果顯示，胃癌原發部位中，胃底、賁門癌CerbB-2陽性率為20.0%，胃體、胃竇癌CerbB-2陽性率為31.3%，胃底賁門癌CerbB-2表達低于胃部癌的表達，差異無統計學意義，而全球胃癌發病的流行病學分析發現歐美國家以食管胃連接部腫瘤多見，而亞洲國家包括日本和我國胃癌發病部位以胃竇體部為多見，食管胃連接部腫瘤相對較少。國內有研究報道胃竇癌發病率明顯高于賁門部癌(45.7%，11.9%)［15］，這種區別也反映了東西方胃癌患者的發病機制不同。更大樣本量的統計需要我們進一步研究以證實。與有關報道［10，11］結論相反，Garcia 等［16］認為CerbB-2水平與胃癌患者的臨床病理特性無明顯關系。還有報道CerbB-2基因的表達與胃癌患者的臨床分期和預后無任何關系［17］。本研究的結果中顯示，CerbB-2陽性表達與TNM分期及腫瘤侵犯深度無關，但與脈管侵犯及神經侵犯密切相關(P＜0.05)，可能與樣本量及胃癌發病流行病學等相關因素有關，但脈管及神經侵犯與患者預后仍密切相關。

赫賽汀對CerbB-2陽性和陰性胃癌細胞，都沒有明顯殺傷效應，但赫賽汀作用陽性細胞48 h后可以明顯下調胃癌細胞 CerbB-2 的表達［18］。Tanner等［6］進行了赫賽汀對胃癌和乳腺癌藥物敏感性比較的研究發現，赫賽汀對CerbB-2高表達的胃癌N87細胞和乳腺癌SKBR－3細胞的抑制率相似，說明兩種腫瘤細胞對赫賽汀的敏感性相同，因此從理論上證明了赫賽汀治療CerbB-2高表達胃癌的有效性。Rebischung等［19］證實赫賽汀聯合化療對CerbB-2過表達的轉移性胃癌有效。一項Ⅱ期臨床研究結果顯示［20］，赫賽汀聯合順鉑治療CerbB-2過表達或擴增的晚期胃癌的客觀有效率比單用順鉑要高。

2009年，關于胃癌研究的國際多中心隨機對照臨床Ⅲ期實驗(ToGA)結果顯示［21］，在標準化治療藥物聯合曲妥珠單抗后，能顯著延長CerbB-2陽性的晚期和不適合手術胃癌患者的生存期，使患者的存活期由11.1月提高到了13.5月，死亡率降低了26%，而且無明顯的不良反應。TOGA試驗發現，若把FISH作為首選篩選病例，只有少數IHC 3+病例會漏選，但會出現較多靶向治療不敏感病例。因此有人認為在胃癌中IHC預測價值比FISH要高。亮視野原位雜交可能比FISH有優勢，這都與胃癌的異質性相關［21］。因此IHC可作為胃癌患者CerbB-2靶向治療初篩，FISH也不能作為首次或唯一決定是否適合靶向治療的檢驗。ToGA研究表明 IHC 3+(無論 FISH狀態)或IHC 2+/FISH+者均可從曲妥珠單抗治療中獲益［22，23］。

本研究免疫組化結果顯示，118例胃癌細胞中Her-2陽性總表達率為24.6%。CerbB-2表達與腫瘤大小、病理類型、Lauren分型、脈管侵犯和神經侵犯有關，而與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤侵襲深度和TNM分期無關。腸型胃癌的表達率(38.3%)明顯高于彌漫型胃癌(18.4%，P＜0.05)。其中 CerbB-2 陽性患者(3+)8例(6.78%)，這些患者可根據具體情況進入赫賽汀輔助治療的臨床研究。而Her－2(2+)患者21例(17.80%)，可進一步采用FISH技術檢測CerbB-2基因擴增情況，以明確是否為CerbB-2陽性胃癌。對于晚期不能手術的胃癌患者，應采取因人而異的個體化治療策略，免疫組化可以對CerbB-2陽性患者進行初步篩選以為個體化治療提供參考依據。

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