細辛煎煮過程中甲基丁香酚、黃樟醚和細辛脂素的變化研究

黃 鮫， 易進海， 劉玉紅， 黃志芳， 陳 燕， 劉云華

(1.成都中醫(yī)藥大學，四川成都610072;2.四川省中醫(yī)藥科學院，四川成都610041)

細辛為馬兜鈴科植物北細辛Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.、漢城細辛 Asarum sieboldii Miq.var.seoulense Nakai或華細辛Asarum sieboldii Miq.的干燥根和根莖［1］，為常用中藥，具有祛風散寒，止痛，通竅，溫肺化飲之功效。細辛有小毒，自古就有“不過錢”之說，2010年版《中國藥典》規(guī)定細辛用量為“1～3 g，散劑每次服0.5～1 g”。但古今眾多醫(yī)家在臨床應用時用量差異甚大，如漢·張仲景《傷寒雜病論》中細辛用量在1.5～18 g之間，較常用的是6～9 g，并在每首方劑后都嚴格要求煎藥的用水量和煎取的藥液量，通過加大煎藥用水量來延長煎煮時間［2-3］;顧蘇俊［4］認為細辛入湯劑時，因其含有揮發(fā)油，用量在1～3 g時，不妨后下，超過3 g以及用量較大時可適當延長煎煮時間;盤慶東［5］在治療類風濕性關(guān)節(jié)炎時，重用細辛入湯劑久煎，療效顯著，未發(fā)現(xiàn)有明顯毒副反應。現(xiàn)代藥理研究證實，細辛的毒性主要表現(xiàn)在呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)方面，其毒性作用主要來源于揮發(fā)油［6］，揮發(fā)油中主要成分甲基丁香酚是一種多位點和多特性的致癌物質(zhì)［7］，黃樟醚不僅有呼吸麻痹作用，而且是毒性較大的致癌物質(zhì)［8］。細辛脂素是細辛非揮發(fā)性成分中的一種木脂素類化合物，具有抗病毒和抗結(jié)核桿菌等作用［9］。王智華等［10］用揮發(fā)油提取器測定細辛10～30 min水煎液中揮發(fā)油的含有量，并利用氣相色譜法測定揮發(fā)油中甲基丁香酚和黃樟醚的含有量，結(jié)果顯示細辛水煎液中甲基丁香酚和黃樟醚的量隨著煎煮時間的延長不斷下降。本實驗基于中藥湯劑煎煮的實際情況，采用HPLC法，直接測定細辛30～120 min水煎液中甲基丁香酚、黃樟醚和細辛脂素的動態(tài)變化，探究細辛久煎對毒效成分的影響，該方法簡便、準確，為細辛的臨床應用提供參考。

1 儀器與材料

Agilent 1200型高效液相色譜儀 (包括四元泵，DAD檢測器，柱溫箱，自動進樣器，工作站);電熱恒溫水浴鍋HHS214;島津AUW220D型10萬分之一電子天平;Sigma3K15高速冷凍離心機;Millipore Milli-Q超純水系統(tǒng)。

甲基丁香酚對照品，購于中國藥品生物制品檢定所 (批號:111642-200301，供定量測定用);黃樟醚對照品，購于CHEM SERVICE(批號03/11，純度≥98%);細辛脂素對照品，購于上海同田生物技術(shù)有限公司 (批號:11032521，純度≥98%);甲醇為美國Fisher色譜純;水為Millipore Milli-Q超純水系統(tǒng)制得的超純水;其余試劑均為分析純。

實驗藥材購于成都荷花池藥材市場，經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學院舒光明研究員鑒定，為北細辛Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricwm(Maxim.)Kitag.的干燥根及根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［11］色譜柱為Agilent Eclipse XDBC18柱 (4.6 mm×150 mm，5 μm);流動相A相為水，B相為甲醇，梯度洗脫，0～10 min(45% ～40%A)，10～15 min(40% ～35%A)，15～30 min(35%～25%A);體積流量1.0 mL/min;檢測波長285 nm;柱溫35℃;進樣量5～50 μL。對照品及樣品的色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品 (A)及細辛樣品 (B)的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)and Asari Radix et Rhizoma(B)

2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取甲基丁香酚10.37 mg、黃樟醚11.01 mg、細辛脂素10.86 mg，分別置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。再分別精密量取上述對照品溶液適量，置同一10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL中含黃樟醚0.1101 mg、甲基丁香酚0.1037 mg、細辛脂素0.0543 mg的混合對照品溶液Ⅰ。精密吸取混合對照品溶液Ⅰ1 mL于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液Ⅱ。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 細辛水煎供試品溶液的制備 取北細辛100 g，加水700 mL，用武火加熱至微沸，用文火保持微沸狀態(tài)，煎煮過程中加水補充損失的水量。分別于30、60、90、120 min精密量取水煎液6 mL置10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，取適量離心 (12000 r/min)5 min，上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得細辛水煎供試品溶液。

2.3.2 細辛藥材供試品溶液的制備 取北細辛粉末 (過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇溶液20 mL，精密稱定質(zhì)量，回流提取1 h，取出，放冷，用甲醇補足減失質(zhì)量，濾過，即得細辛藥材供試品溶液。

2.4 檢測限和定量限 在選定的色譜條件下，當信噪比為3時，計甲基丁香酚、黃樟醚和細辛脂素的檢測限 (LOD);當信噪比為10時，計甲基丁香酚、黃樟醚和細辛脂素的定量限 (LOQ)，結(jié)果見表1。

表1 各成分的線性關(guān)系、檢測限和定量限Tab.1 Linear relation，limits of detection(LOD)and limits of quantification(LOQ)of components

2.5 線性關(guān)系 精密吸取2.2項下混合對照品溶液Ⅰ4、8、10、15、20 μL 和混合對照品溶液Ⅱ1、2、4、8、10、20 μL注入液相色譜儀中，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸計算，結(jié)果見表1。該方法在實驗范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液50 μL，注入液相色譜儀，重復進樣5次，按2.1項下色譜條件測定，甲基丁香酚、黃樟醚和細辛脂素的峰面積的 RSD分別為0.98%，1.67%，0.27%，表明色譜系統(tǒng)的精密度好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液50 μL，注入液相色譜儀，分別于 0、2、4、8、12、24 h檢測，記錄色譜圖，甲基丁香酚、黃樟醚和細辛脂素的峰面積的RSD分別為2.05%，2.78%，0.65%，表明供試品溶液24 h內(nèi)測定穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗 取細辛30 min水煎液5份，按供試品制備方法制備，按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖，甲基丁香酚、黃樟醚和細辛脂素質(zhì)量分數(shù)分別為0.2216，0.0485，0.0865 mg/g，RSD分別為1.13%，3.37%，0.43%，表明該方法重復性好。

2.9 加樣回收率試驗 按2.3項下供試品溶液的制備方法，精密量取細辛30 min水煎液3 mL，共6份，準確加入適量對照品溶液，照2.3.1項操作，測定，計算回收率。結(jié)果甲基丁香酚、黃樟醚和細辛脂素的平均回收率分別為103.96%，98.77%和105.78%;RSD分別為0.64%，1.92%和0.53%。

2.10 樣品測定 分別精密吸取細辛藥材供試品溶液和細辛水煎供試品溶液5～50 μL注入液相色譜儀，在2.1項色譜條件下進行測定，計算各樣品中甲基丁香酚、黃樟醚和細辛脂素的含有量 (以生藥計)，結(jié)果見表2。

表2 細辛藥材及湯劑測定結(jié)果Tab.2 Results of content determination in Asari Radix et Rhizoma decocted fluid

3 討論

3.1中藥湯劑是中醫(yī)臨床上應用最廣泛的一種傳統(tǒng)劑型，古今眾多醫(yī)家在使用細辛時，多采用湯劑入藥，并要求先煎或久煎。故本實驗根據(jù)細辛湯劑煎煮現(xiàn)狀，采用HPLC法，測定細辛藥材及細辛30、60、90、120 min水煎液中主要毒效成分甲基丁香酚、黃樟醚和細辛脂素。結(jié)果顯示，細辛藥材中甲基丁香酚、黃樟醚和細辛脂素的含有量分別約為細辛30 min水煎液的20、100、25倍，且細辛湯劑中揮發(fā)性成分甲基丁香酚和黃樟醚的量隨煎煮時間延長迅速下降，非揮發(fā)性成分細辛脂素的量隨著煎煮時間延長逐漸增加。由此可見，細辛湯劑先煎或久煎，可以顯著減少毒性成分甲基丁香酚和黃樟醚，亦有利于有效成分細辛脂素的溶出，這為臨床用細辛入湯劑時先煎和久煎提供了科學依據(jù)。

3.2 細辛的毒性大小與藥用部位、劑型、煎煮時間等密切相關(guān)，如表2顯示細辛水煎液中甲基丁香酚和黃樟醚的含有量遠低于細辛藥材，且隨煎煮時間延長迅速下降。細辛“不過錢”是針對散劑“單用末”而言，入湯劑時可根據(jù)先煎或久煎來增加細辛用量。因此，細辛用量應根據(jù)患者的病征、用藥的方法和劑型等不同酌情增減，建議中國藥典可適當增加細辛湯劑的用量范圍。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:214.

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