京大戟醋制前后大戟二烯醇和甘遂甾醇的變化

曹雨誕， 耿欣欣， 陳海鷹， 張 麗

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210046)

京大戟為大戟科植物大戟Euphorbia pekinensis Rupr.的干燥根［1］，具有瀉水逐飲、消腫散結(jié)的功效。其性寒，味苦，有毒;由于其生品毒性較大，故臨床上常用其炮制品。歷版中國(guó)藥典均采用醋制來(lái)降低京大戟的毒性［2］，但有關(guān)其醋制減毒的物質(zhì)基礎(chǔ)研究報(bào)道相對(duì)較少。有研究表明，京大戟根中二萜、三萜類成分可能為其毒性成分［3］，而大戟二烯醇和甘遂甾醇均為三萜類成分［4］。因此本實(shí)驗(yàn)以京大戟中指標(biāo)性成分大戟二烯醇［5］和甘遂甾醇為指標(biāo)，采用高效液相色譜法［5-6］考察京大戟醋制前后大戟二烯醇和甘遂甾醇的變化，為進(jìn)一步研究京大戟醋制減毒物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理提供參考。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Waters2695高效液相色譜系統(tǒng) (2489紫外/可見檢測(cè)器，Empower色譜工作站)，F(xiàn)W-100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) (天津市泰斯特儀器有限公司)，F(xiàn)A1104N電子天平 (d=0.1mg，上海精密科學(xué)儀器有限公司)，DL—I—15臺(tái)式封閉電爐 (天津市泰斯特儀器有限公司)，BP211D電子天平 (d=0.01mg，德國(guó)賽多利斯)，KQ—500型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)，HH-S恒溫水浴鍋 (江蘇國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)，Anke TGL—16B型離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 試藥 京大戟藥材采購(gòu)自安徽省亳州市藥材總公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)樂(lè)巍副教授鑒定為大戟科植物大戟 Euphorbia pekinensis Rupr.的干燥塊根。京大戟生品 (取生京大戟飲片，除去雜質(zhì)，大小分檔，打粉);京大戟醋制品 (取生京大戟數(shù)個(gè)，大小分檔后，加30%量食醋拌勻，浸潤(rùn);加入純凈水，文火煮沸，煮至醋被吸盡;取出，室溫晾干，40℃烘箱干燥;打粉)。

大戟二烯醇和甘遂甾醇對(duì)照品 (自制，純度經(jīng)HPLC歸一化法測(cè)定大于98%)，乙腈 (色譜純)，甲醇 (色譜純)，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent XDB C8色譜柱 (150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水 (93 ∶7)，體積流量 1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取減壓干燥至恒定質(zhì)量的大戟二烯醇對(duì)照品52.44 mg和甘遂甾醇對(duì)照品21.32 mg，分別置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得對(duì)照品貯備溶液。再分別精密吸取上述對(duì)照品貯備溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取京大戟生品和醋制品粉 (過(guò)65目篩)約0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入乙酸乙酯25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理 (功率250 W，頻率50 kHz)40 min，再次稱定，用乙酸乙酯補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液10 mL，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取上述混合對(duì)照品溶液1、2、5、10、20 μL，按 2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積值Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算大戟二烯醇和甘遂甾醇回歸方程:Y=394058.8X－38209.7(r=0.9999)，Y=174098.5X+30030.5(r=0.9998)。結(jié)果表明大戟二烯醇在進(jìn)樣量0.5244～10.4880 μg范圍內(nèi)，甘遂甾醇在進(jìn)樣量0.2132～4.264 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按2.1項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定峰面積，結(jié)果大戟二烯醇和甘遂甾醇的RSD分別為0.62%和0.45%，表明該方法的精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取京大戟醋制品約0.5 g，平行6份，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，得大戟二烯醇和甘遂甾醇的RSD分別為0.83%和0.72%。結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一京大戟醋制品供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)樣測(cè)定，得大戟二烯醇和甘遂甾醇峰面積的RSD分別為1.28%和1.26%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含有量的醋制京大戟粉末6份，每份0.25 g，精密加入對(duì)照品貯備溶液各0.5 mL，按2.3項(xiàng)下制成供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率。得大戟二烯醇的加樣回收率為97.36%，RSD為1.07%;甘遂甾醇的加樣回收率為98.72%，RSD為0.77%。結(jié)果見表1和表2。

表1 大戟二烯醇的加樣回收率試驗(yàn)Tab.1 Recovery test of euphol

表2 甘遂甾醇的加樣回收率試驗(yàn)Tab.2 Recovery test of tirucallol

2.5 樣品測(cè)定 取京大戟生品和京大戟醋品按2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法依法制備，以平均峰面積，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法利用回歸方程計(jì)算大戟二烯醇和甘遂甾醇的含有量，測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 京大戟醋制前后大戟二烯醇和甘遂甾醇的比較(n=3)Tab.3 Comparison of euphol and tirucallol contents for crude Euphorbiae Pekinensis Radix before and after processing with vinegar(n=3)

3 討論

3.1 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn) ［5-7］，選擇了不同溶劑 (甲醇﹑乙醇及乙酸乙酯)超聲提取，同時(shí)又考察了提取時(shí)間，結(jié)果表明，樣品用乙酸乙酯超聲提取40 min效果最佳。

3.2 由于大戟二烯醇和甘遂甾醇在210 nm處有最大吸收，故檢測(cè)波長(zhǎng)選擇為210 nm，使得各成分在其最大吸收波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定，從而提高了分析精度，保證了方法穩(wěn)定性。采用Agilent XDB C8色譜柱 (150 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-水、甲醇-水為流動(dòng)相，按不同比例進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)以乙腈-水 (93∶7)色譜系統(tǒng)能把大戟二烯醇與其同分異構(gòu)體甘遂甾醇獲得較好的分離效果。

3.3 有研究表明，大戟二烯醇對(duì)人正常肝細(xì)胞和人正常胃黏膜上皮細(xì)胞均有一定的增殖抑制作用［8］，當(dāng)京大戟醋制后其含有量略有降低［9-10］。本實(shí)驗(yàn)考察了京大戟醋制前后三萜類成分大戟二烯醇和甘遂甾醇的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大戟二烯醇和甘遂甾醇經(jīng)醋制后含有量都有降低，這可能是由于在醋制過(guò)程中加入了水，加速了萜類化合物的分解，降低了京大戟的毒性。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)京大戟醋制減毒物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理的深入研究提供了依據(jù)。

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