TLRs信號轉導通路及負調控分子研究進展*

福建醫科大學基礎醫學院 聶惠蓉 泉州師范學院生物學系 李裕紅 福建醫科大學基礎醫學院 劉迎春

Toll蛋白最早發現于果蠅胚胎發育過程中,在背腹側體軸細胞的形成過程中起重要調控作用[1,2]。Toll樣受體是一類病原相關模式識別受體（PRR），該家族與果蠅的Toll蛋白家族在結構上有高度同源性。TLRs廣泛表達于哺乳動物等細胞表面，是一種跨膜信號轉導蛋白。通過識別微生物的PAMPs或自身的內源性配體激活胞內信號通路，從而誘導產生促炎性細胞因子、趨化因子、干擾素和共刺激因子，在機體識別和清除病原微生物、介導下游細胞因子產生、天然免疫防御、連接先天性和獲得性免疫中發揮重要作用。

1 TLRs的結構、分布及配體研究

1.1 TLRs的結構與在細胞內的定位

TLRs屬于 I型跨膜受體，由胞外區、跨膜區和胞內TIL(Toll/IL-R1)區組成。胞外區富含亮氨酸重復序列，約550～980個氨基酸，可識別病原微生物的 PAMPs；跨膜區是富含半胱氨酸的區域；胞內TIL(Toll/IL-R1) 約有200個氨基酸,為所有TI R及 IL-l R分子胞內段所共有。該結構域可以與胞內其他帶有相同TI R結構域的分子發生相互作用，啟動信號傳遞，是信號傳導的主要區域[3]。目前，在人體中相繼發現了11個TLRs，即TLR1～11, 小鼠中不表達TLR10 但發現了人沒有的 TLR11～13[4]。根據TLRs細胞內定位的不同，可將其分為兩類，即位于細胞膜表面的TLR1、TLR2 、TLR4、TLR5、TLR6、TTLR11和位于細胞內細胞器膜 (如細胞內體、溶酶體或內質網膜) 的 TLR3、TLR7／8和TLR9。胞內細胞器膜的TIRs識別病毒和細菌的核酸。當細胞通過自吞噬作用將病毒粒子吞入細胞后，被細胞內體或溶酶體融合并將衣殼降解導致其核酸釋放，從而被TLRs識別[5]。此外，研究證明，定位于胞內的 TLRs對于識別病毒 RNA、DNA和自身的RNA、DNA是十分重要的。例如，當 TLR9的跨膜區和胞質區與 TLR4發生替換時，產生的嵌合蛋白( TLR9N4C) 被置換到質膜上[6]。這種嵌合蛋白能夠識別病毒和細菌的CpG DNA，卻不能識別自身的DNA。值得注意的是，這種嵌合蛋白表達于巨噬細胞表面，這些細胞可以識別自身的DNA。由于對自身DNA的異常識別是引起自身免疫性疾病的原因。因此推斷，TLR定位于胞內可防止自身免疫性疾病的發生。

1.2 TLRs的配體

TLRs的基因分散地分布在不同的染色體中，其中TLR1、TLR2、TLR3和TLR6基因定位于4號染色體，TLR4和TLR5基因分別定位于9號和1號染色體，TLR7和TLR8基因定位于染色體Xp22，TLR9基因定位于3p21.3。TLR11為 TLRs家族新成員，主要表達于泌尿系統。TLRs的配體按其來源可分為內源性和外源性配體（見表 1）。內源性配體主要是宿主的成分, 如熱休克蛋白、細胞外基質降解成分等。外源性配體主要是微生物進化過程中的保守成分, 如細菌的脂多糖、胞壁酸、肽聚糖以及細菌和病毒的核酸等。

表1 TLRs的配體及其來源[3～7]

2 TLRs的信號轉導通路

Toll樣受體可在多種免疫細胞中表達，如單核細胞／巨噬細胞、中性粒細胞、 樹突狀細胞及未成熟樹突狀細胞，還可在血管內皮細胞、心肌細胞和腸上皮細胞表達。TLRs 識別并結合 PAMPs 或內源性配體導致下游信號事件和轉錄因子的激活，從而誘導抗微生物分子、化學趨化因子、細胞因子和共刺激分子的表達。據研究報道，主要有兩條信號通路途徑，一是依賴于髓樣分化因子88（MyD88）信號轉導途徑，另一是非依賴于髓樣分化因子88（MyD88）信號轉導途徑。除 TLR3外，所有的TLRs都可以通過MyD88介導下游的信號轉導。

2.1 MyD88依賴的TLRs的信號轉導途徑

My D88是一種35k Da的胞漿內蛋白質，為TLRs信號途徑中普遍存在的接頭分子，同時也是 TIR／IL-1R超家族的重要成員之一。它的C端含TIR結構域，與TLRs胞內區的TIR結合，N端則是死亡結構域( death domain，DD) 。TLRs與 My D88的結合后，招募 IRAKs (interleukin receptor associated kinase )家族，包括 IRAK1、IRAK2、IRAK4和IRAK-M。其中IRAK4是激活依賴于MyD88不可缺少的關鍵分子[8,9]，一旦IRAK4被磷酸化，就會與MyD88分子分離，進而與TRAF6 (TRAFs家族成員)發生相互作用。TRAK1與TAB1、2、3結合活化兩條下游途徑，其中包IKK ( IKBkinase )復合體和MAPK( mitogen-activated protein kinase )家族。IKK復合體由具有催化作用的IKK-d、IxB、IKK-p和IKK-y/NEMO亞基組成，它可以催化IкB蛋白磷酸化。這種磷酸化可引起IкBs的降解以及NF-кB的激活是不可或缺的；而MAPKs的磷酸化則激活轉錄因子AP-1( activator protein-1 )。AP-1是來源于Jun、Fos、ATF和Maf等分子的一段富含亮氨酸的二聚體，而c-Jun基因在TLRs激活炎性細胞因子的信號轉導通路中起到重要作用。對來源于TAK1缺陷性小鼠的細胞研究發現， TLRs信號通路中的NF-кB與MAPKs的激活受到抑制，炎性細胞因子的表達也進一步下調[10]。這表明，AK1在NF～кB與MAPKs活化的信號轉導通路中起到不可替代的作用，但TAK1 ( TGF-b-activated kinase1)如何活化IKK復合體和MAPKs，卻仍然不清楚。

對 TAK1泛素化的研究發現，盡管 Ubcl3 ( ubiquitinconjugating enzyme )與 NF ～кB 和 MAPKs 的激活有關，但在Ubc l3缺陷型小鼠，它對NF～кB 的激活可有可無。Ubc l3缺陷型巨噬細胞，在各種TLRs 配體刺激下顯示出缺乏產生炎性細胞因子的能力，即MAPKs的激活受到抑制，而NF ～кB的激活卻未受到影響，這表明Ubcl對MAPKs的激活是必要的。值得關注的是，Ubcl3的缺乏對TAK1的活化和TRAF6的泛素化不產生影響。在TLRs通路中，由于TAK1和TRAF6對MAP Ks和NF ～кB的激活十分重要。因此，推斷Ubcl3對 MAPKs 激活通路是不依賴于TAK1和TRAF 6，它位于TAK1/TRAF6的下游。在Ubc l3缺陷型細胞中，當Ubc l3缺乏時，Ubc 5就會激活NF ～кB，特別是 IKK- 7/NEMO的泛素化顯著降低。這預示依賴于 Ubcl3的 IKK-7/NEMO( NF～кB essential modulator )的泛素化和MAPKs的活化之間存在一定的聯系[11]。

除 TAK1之外，還有其他的MAPKs與TLR4信號通路有關。當受到LPS刺激后，MEKK3缺陷型巨噬細胞并不能激活JNK和p38產生IL-6[12]。與之相反，雖然Tpl-12缺陷的巨噬細胞受到LPS刺激后ERK的活化與TNF-α的表達受到嚴格的抑制，但能夠激活，JNKs ( c- Jun N-terminal kinases )和p38。研究表明，ABIN2 (一種捆綁A20分子的NF ～кB抑制劑) 能穩定Tpl-12對ERK的激活。對ASK1缺陷型脾細胞和DC的研究表明，p38活化以及IL-6、TNF-α 的分泌受到抑制。LPS刺激ROS的表達與TRAF6-AS K1- p 38 信號通路的建立有關[13]?？傊琈APKs的激活決定了TLR4介導的炎癥反應。

2.2 MyD88非依賴的TLRs的信號轉導途徑

MyD88基因敲除鼠在應答TLR2、TLR7和TLR9配體時未發現NF ～кB和JNK的活化。然而，關于TLR4的刺激，雖然MyD88基因敲除的細胞在應答LPS時不產生任何炎癥細胞因子，但卻可以觀察到LPS誘導的NF ～кB和JNK的延遲活化。Kawai等[14]分別從有LPS刺激和無LPS刺激的敲除MyD88基因的巨噬細胞中提取mRNA，發現存在LPS刺激時，MyD88基因敲除細胞有 IFN誘導的基因的表達，如IP-10和GARG16。后來的系列研究充分證實，存在MyD88依賴和MyD88非依賴兩條TLRs信號途徑。在MyD88非依賴信號途徑中，LPS的刺激，使轉錄因子干擾素調節因子 3( interferon regulate factor 3，IRF3 )活化，誘導IFN-13表達。IFN-13再依次激活Statl, 進而導致幾個IFN誘導的基因的表達[15]。

研究顯示，在MyD88基因敲除細胞，除 TLR4配體，TLR3配體dsRN A亦可活化NF ～кB。病毒和病毒衍生dsRNA是IRF -3的有效激活子，活化的IRF-3啟動IFN-β基因表達。故TLR3配體dsRNA能激活MyD88非依賴途徑，在此途徑中，IRF-3發揮著重要作用。那么哪些激酶負責IRF-3的活化呢? Sharm等[16]采用酵母雙雜交技術篩選了與IRF-3相互作用的分子，發現 IRF-3 和 IкB 激酶 ( IкB kinases，IKKs )密切相關。IKKs由IKKα和IKKβ組成，兩者均磷酸化IкBα的Ser32和Ser36，誘導NF～кB活化。此外，有兩個非經典的IKKs：TRAF 聯合 NF～кB 激酶( TRAF joint NF ～кB kinase，TANK) 結合激酶1 (TANK-binding kinase 1,TBK1 )和IKKε／IKKi 。與經典的IKKα和IKKβ比較，具有不同的激酶活性。體外激酶分析發現TBK1和IKKε／IKKi能夠誘導IRF-3磷酸化；用RNA干擾介導技術刪除TBK1和IKKε／IKKi 后，病毒誘導的IRF-3磷酸化則被抑制。Fitzgerald和同事[17]也發現 TBK1和IKKε／IKKi 能活化IRF-3、誘導IFN-β表達；當通過RNA干擾作用降低TBK和IKKε／IKKi 表達，則發現應答病毒和dsRNA時，IFN-β表達受損。所以，應答TLR3配體時，TBK1和IKKε／IKKi發揮關鍵作用。值得注意的是，K63多泛素作用在IRF活性中同樣發揮重要作用， Zeng等[18]研究發現內源性泛素 K63R突變會導致病毒活化的 IRF3失活。

3 TLRs信號通路中的負性調控因子

TLRs的激活一方面可刺激先天性和獲得性免疫反應來保護機體，但另一方面如引起持續炎癥反應則會對機體產生損傷。自身免疫、慢性炎癥和感染性疾病均與它有一定的關系。例如LPS持續刺激TLR4會產生嚴重的敗血癥和感染性休克。此外，類風濕性關節炎、慢性阻塞性肺心病、結腸炎、哮喘、肌病、紅斑狼瘡和動脈粥樣硬化等也與TLRs的激活有關。因此，TLRs的激活必須受到嚴格的負向調控，以保持機體免疫系統的穩定[19]。

3.1 ⅠRAK-M和 Tollip分子

適當的炎癥反應可以有效地清除入侵的病原微生物保持機體健康，但是免疫系統過度活化對機體有害無益，在某些情況下超量的細胞因子會引發嚴重的炎癥反應, 引起組織損傷甚至循環衰竭, 導致死亡。如上所述，IRAK-M 通過抑制IRAK與TLR受體復合物的解離，對巨噬細胞 TLRs活化信號起負調控作用。除此之外，靜息細胞中Tollip分子與IRAK形成復合物，可通過抑制IL-1和TLRs介導的IRAK磷酸化抑制細胞活化[20,21]。

3.2 MyD88s 分子

MyD88s ( MyD88 short)是MyD88分子的差異剪切體，主要表達在脾細胞，單核細胞受LPS刺激后，可上調MyD88s的表達。MyD88s雖可結合IL-1R和IRAK，但不能誘導IRAK磷酸化和隨后的 NF～кB活化；相反，它能阻止 IRAK-4與TLR受體復合物的結合，對TIRs和IL-1活化信號起負調控作用[ 22 , 23 ]。

3.3 SⅠGⅠRR 分子

SIGIRR (Single immunoglobulin IL -1R-related molecule)又稱 Tir8 (Translationiniia-tionregion8), 基因定位于染色體11p15.5，為單鏈Ig / I L-1R相關受體超家族成員，含 Ig和TIR兩種功能域,但 TIR中無傳遞信號所必需的保守氨基酸Ser 447和Tyr536[8]。SIGIRR主要表達在上皮細胞和樹突狀細胞，高表達SIG IRR的293細胞能有效抑制IL -1和IL -18誘導的NF～кB報告基因轉錄活性；SIGIRR基因缺陷可使LPS和CpG誘導 DC分泌更多的細胞因子和趨化因子，但對TNF-α誘導的DC活化無影響。因此它是 TLR / IL-1R的負性調控因子, 并主要在調控胃腸道系統的炎癥反應中起重要作用[24]。IL-1作用于細胞后，SIGIRR與 IRAK 和TRAF6結合，提示SIGIRR通過與IL-1受體復合物結合發揮負性調節作用[25]。相對于IRAK-M、tollip和MyD88s等TLRs信號的胞內抑制性分子, SIGIRR為胞外抑制性分子，因此胞內以及胞外抑制性分子之間的協同作用，共同對 TLRs活化進行精細的調節。

3.4 其他的負調節分子

除上述分子，PI 3-K( Phospho inositide 3 -kinase)和SOCS-1( Suppressor of cytokine signaling -1）也參與對 TLR 信號的負調節[26]。PI 3-K是 TLR2誘導IL-12分泌的內源性抑制分子，在細胞中組成性表達, 被認為在TLR信號的早期階段或第一次接觸病原體時發揮作用；而IRAK-M 和SOCS-1可被TLR誘導表達，因此在二次刺激或病原體持續存在時發揮負調節作用，與LPS耐受的形成有關。機體還可通過下調細胞TLR4表達水平誘導 LPS耐受，降低對LPS的反應性[27]。

4 小結

當病原微生物感染時，機體的TLRs通過復雜的、多層次的調控來實現其介導的信號轉導。首先，TLRs與胞內的接頭分子相互作用激活多條信號轉導通路， 啟動機體的先天性免疫反應和促進獲得性免疫反應，產生炎癥反應，清除病原微生物。其次，機體通過啟動自身的負向調控系統來抑制TLRs信號轉導通路，使機體恢復免疫平衡。深入研究 TLRs的結構和信號轉導途徑，以及它們與免疫細胞的相互作用，探討可能的干預及治療措施，可為相關疾病的臨床治療和用藥提供新的靶位點。

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