參芍口服液對冠狀動脈粥樣硬化大鼠主動脈IL-8、VCAM-1和ICAM-1表達的影響

薛忠文， 董天崴， 張 琦， 徐丁潔， 王 晨， 尚小明*

(1.河北醫科大學，河北石家莊050000;2.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江佳木斯154002;3.河北醫科大學附屬唐山市工人醫院，河北唐山063000)

冠心病作為一種系統性纖維增生炎癥性疾病是導致中老年死亡的首要原因，據統計目前我國約有2000萬人患有冠狀動脈性疾病［1］。現代醫學認為冠心病的發病基礎為冠狀動脈粥樣硬化，治療應當改變不良的生活習慣，戒煙，低脂飲食，減輕體質量，適當運動;藥物如辛伐他汀、普伐他汀等副作用及長期應用的安全性有待進一步評估;介入治療仍無法完全克服支架術后再狹窄、延遲性血栓問題。中醫藥在冠狀動脈粥樣硬化治療中具有整體論治、辨證分治等特點，具有獨特優勢，已成為冠狀動脈粥樣硬化治療中的一種新選擇。本實驗通過研究參芍口服液對冠狀動脈粥樣硬化模型大鼠血脂指標和主動脈IL-8、VCAM-1和ICAM-1表達的影響，探討其抗動脈粥樣硬化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD雄性大鼠50只，鼠齡3個月，體質量150～180 g，由北京維通利華有限公司提供，清潔級動物，合格證號 SCXK(京):0175819，2010-0038。隨機分為5組:正常組、模型組、治療組 (參芍口服液高劑量組、參芍口服液低劑量組、辛伐他汀組)，每組各10只。

1.2 主要試劑 參芍口服液 (藥物組成:丹參250 g，黃芪250 g，赤芍藥150 g，當歸150 g，川芎75 g，桃仁125 g，紅花75 g，水蛭187.5 g，地龍250 g，清半夏125 g。河北省唐山市工人醫院制劑室制備，制劑號:Z20050957，10 mL/支);維生素D3(上海通用藥業股份有限公司);辛伐他汀(杭州默沙東制藥有限公司);IL-8兔抗鼠多克隆一抗 (BA2189，北京博奧森生物技術有限公司);ICAM-1兔抗鼠多克隆一抗 (bs-1378R，北京博奧森生物技術有限公司);VCAM-1兔抗鼠多克隆一抗 (BA0406，武漢博士德生物技術有限公司);羊抗兔多克隆二抗 (北京博奧森生物技術有限公司);羊抗兔IgG-AP、免疫組化SABC試劑盒 (武漢博士德生物技術有限公司);DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3 造模方法及分組 SD雄性大鼠50只，隨機分為5組:正常組、模型組、治療組 (參芍口服液高劑量組、參芍口服液低劑量組、辛伐他汀組)，每組各10只。正常組常規飼養，模型組和治療組大鼠給予高脂飲食+維生素D3600000 IU/(kg·d)腹腔注射3 d。4周后，灌胃給藥，參芍口服液高、低劑量組分別按8 mL/d、4 mL/d給藥，辛伐他汀組按5 mg/(kg·d)給藥，其余組給予生理鹽水，給藥8周。

1.4 取材方法 給藥8周后處死，頸總動脈取血，ELISA法測定血清血脂指標;取完整主動脈 (從主動脈根部至髂總動脈分叉處)，一部分置4%多聚甲醛中固定，行免疫組化和HE染色;另一部分放入凍存管保存在－80℃冰箱中，用于免疫印跡檢測，觀察IL-8、VCAM-1和ICAM-1的表達。

1.5 免疫組織化學染色 按試劑盒說明進行，IL-8和ICAM-1蛋白陽性表達定位于胞漿。Image pro plus圖像分析軟件進行圖像分析，每張切片隨機選取6個視野 (各采集200×圖像)，計算該樣本的平均積分光密度值 (integral optical density，IOD)。1.6 免疫印跡 取大鼠胸主動脈組織100 mg勻漿，按試劑盒說明進行。以Image J軟件對蛋白表達條帶進行掃描及平均光密度值 (average optical density，OD)的定量分析。

2 結果

2.1 形態學觀察 ①正常組動脈內膜、中膜和外膜結構完整，層次清晰。內膜為單層扁平狀內皮細胞及其基質，內膜光滑完整，無增生，厚薄均勻，內皮細胞結構連續完整，層次清楚而光滑;中膜為長梭形的平滑肌細胞，排列整齊，細胞周圍充滿膠原和彈力纖維組織;外膜較薄，為疏松結締組織，內含少量平滑肌細胞。②模型組動脈管壁三層結構不清晰，內膜粗糙，可見大面積增厚、隆起，內皮細胞有缺失，形成斑塊，內有泡沫細胞，深部可見無細胞的不定型物質，其中含有膽固醇結晶、壞死組織和少量纖維素，在內膜下發現遷移的平滑肌細胞，其胞漿著色淺，似有脂質，中膜平滑肌細胞仍有增生，排列不規則，并向內膜遷移，病變演化為動脈粥樣硬化早期脂質條紋。③參芍口服液低劑量組血管內膜粗糙，管壁增厚，中膜平滑肌增生，但病變程度較模型組輕。④參芍口服液高劑量組血管內膜局部內皮粗糙，有少量內皮細胞缺失，平滑肌細胞增生較少，病理改變明顯好于模型組。⑤辛伐他汀組部分血管內皮粗糙，有少量內皮細胞缺失，中膜平滑肌細胞輕度增生，與參芍口服液高劑量組相似，病理改變明顯好于模型組 (圖1)。

圖1 大鼠主動脈病理形態觀察及IL-8和ICAM-1蛋白的表達Fig.1 Aortic pathological observation of rat and IL-8，ICAM-1 protein expression

2.2 TC、TG、LDL-C的變化 模型組TC、TG、 LDL-C顯著高于正常組，差異均具有統計學意義(均P＜0.05)。給予參芍口服液和辛伐他汀治療后，TC、TG、LDL-C表達明顯下調，與模型組比較，差異均具有統計學意義 (均P＜0.05)。高、低劑量組之間比較，差異具有統計學意義 (P＜0.05)。見表1。

2.3 主動脈IL-8、VCAM-1、ICAM-1的表達 免疫組織化學結果顯示 (圖2):正常組無 IL-8、ICAM-1的表達。模型組血管內膜IL-8、ICAM-1表達較高。經參芍口服液及辛伐他汀治療后，IL-8、ICAM-1表達較模型組下降，與模型組比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05)。高劑量組較低劑量組下降明顯，具有統計學意義 (P＜0.05)。和辛伐他汀組比較無統計學差異 (P＞0.05)。

表1 參芍口服液對血脂的影響 (±s，n=10)Tab.1 Effect of Shenshao Oral Liquid on lipids(±s，n=10)

表1 參芍口服液對血脂的影響 (±s，n=10)Tab.1 Effect of Shenshao Oral Liquid on lipids(±s，n=10)

注:與正常組比較，#P＜0.05;與模型組比較，*P＜0.05;與低劑量組比較，△P＜0.05。

組 別TC/(mol·L －1)TG/(mol·L －1)LDL-C/(mol·L －1)正常組1.20±0.09 0.65±0.05 0.71±0.06模型組 18.07±1.02# 0.87±0.04# 10.56±0.53#低劑量組 12.77±0.86* 0.692±0.06* 7.46±0.26*高劑量組 9.40±0.49＊△ 0.38±0.04＊△ 6.83±0.12＊△辛伐他汀組 5.24±0.09* 0.41±0.03* 6.32±0.10*

圖2 主動脈中IL-8、VCAM-1和ICAM-1蛋白的表達 (±s)Fig.2 Expressions of IL-8，VCAM-1 and ICAM-1 protein in aorta

免疫印跡結果顯示 (圖2，圖3):與正常組比較，模型組的IL-8、VCAM-1和ICAM-1表達條帶增強，差異具有統計學意義 (P＜0.05)。經參芍口服液及辛伐他汀治療后，IL-8、VCAM-1和ICAM-1蛋白表達減弱，與模型組比較，差異均具有統計學意義 (均P＜0.05)。高劑量組較低劑量組下降明顯，具有統計學意義 (P＜0.05)，和辛伐他汀組比較無統計學差異 (P＞0.05)。

3 討論

冠狀動脈粥樣硬化是嚴重危害人類健康的常見疾病。中醫冠狀動脈粥樣硬化無病名，根據其臨床表現，多屬于“胸痹”、“中風”、“真心痛”、“頭痛”、“脫疽”等病證范疇［2］。中醫認為，本病是臟腑功能失調，痰濁蘊聚、瘀熱互結的結果，其發病機制可以概括為痰、瘀、虛、毒的本虛標實之癥［3］。治療上從整體觀念出發，立足辨證施治，采用活血化瘀、化痰通絡、益氣補虛等法治療本病，療效肯定、無毒副作用［4］。

圖3 主動脈內IL-8、ICAM-1蛋白的表達 (免疫印跡)Fig.3 Expression of IL-8，VCAM-1 and ICAM-1 protein(western blot)

課題組根據多年臨床經驗，認為本病雖病因眾多，但最終歸結為“瘀血阻滯，郁結于血脈”的主要病機，根據“久病必瘀”、“久病必虛”的中醫理論，以“活血化瘀、益氣通絡”為法而立方參芍口服液。參芍口服液是由補陽還五湯加味而來，由丹參、黃芪、當歸、川芎、赤芍、桃仁、紅花、地龍、水蛭、清半夏組成。本方重用丹參為君藥，其性苦，微寒，活血化瘀止痛;黃芪大補元氣，使氣旺則血行，當歸活血和血，兩藥配合君藥有活中兼養，祛瘀不傷血之妙，是為臣;川芎、赤芍、桃仁、紅花助君增強活血化瘀之效;地龍、水蛭蟲類藥，長于行散走竄，通經活絡;清半夏辛，溫，化痰散結，臨床病程遷延，防痰瘀互結加重病情;以上均為佐藥。綜觀全方，諸藥合用，融活血化瘀，益氣通絡為一體，以“疏其血，補其氣，經通脈順”，諸癥自愈。現代藥理研究，活血化瘀藥物具有多種生物活性，能增加外周血流量，抑制炎癥、保護血管內皮，抗血栓等作用［5］。

冠狀動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的病理基礎［6］，炎癥反應在其發生、發展中起重要作用［7］。研究表明，過量IL-8的表達可引起單核細胞的趨化，促進單核細胞與內皮細胞間牢固黏附的因子以及平滑肌細胞增生和遷移，促進斑塊形成［8-9］。ICAM-1、VCAM-1在動脈粥樣硬化的炎癥反應中發揮著重要作用，能夠調節白細胞在血管內皮上的遷移和黏附，介導循環血液中外層部分單核細胞著邊，黏附和遷移，一般很少表達于正常的冠狀動脈血管［10-12］。

本研究結果顯示，模型組血脂水平增高，IL-8、ICAM-1、VCAM-1高表達于損傷的內皮細胞和粥樣硬化斑塊內，給予參芍口服液治療后，血脂水平降低，IL-8、ICAM-1、VCAM-1表達下降，效果同辛伐他汀治療，提示參芍口服液通過改善血液脂質代謝，抑制炎癥因子的表達，從而發揮抗炎作用，抑制動脈粥樣硬化的形成。冠狀動脈粥樣硬化的形成，與脂質浸潤、血小板黏附聚集、炎癥反應、血管內皮受損、免疫功能失調、血管平滑肌增殖遷移、氧自由基損傷等多個作用環節有關［13］。本實驗結果顯示參芍口服液多環節因素延緩、減輕甚至逆轉斑塊的進展。從血脂調節，炎癥反應方面探討了中醫藥治療冠狀動脈粥樣硬化多靶點、多環節的優勢，為中醫藥治療冠狀動脈粥樣硬化提供了新的思路和線索。

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