光照節律改變對大鼠視網膜的影響及中藥干預作用的研究

徐金華 王育良 林 琳 柏玉潔

“天人相應”是中醫認識人體的理論基礎，認為機體的陰陽盛衰與日、地、月運行息息相關。近年來生物學研究證實生物體內存在生物鐘，調控著機體生命活動和生理功能，與日、地、月運行的周期相適應。現代環境醫學亦揭示自然環境變化可通過調控生物鐘影響人的生理功能等，強調了人的生理病理狀態與自然環境如晝夜交替、季節交替等密切相關，其中最為關鍵的自然環境變化是晝夜的長短，即光照節律的變化〔1〕。本文主要研究光照節律改變對大鼠視網膜結構和功能的影響，以及中藥的調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及設備：健康無眼病SD大鼠（上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供），鼠齡3周，雌性，75～85 g，均為清潔級動物。普通家庭用36 W日光燈（菲利普照明公司）1個，定時調控開關（上海石泰電器有限公司）1個。自制光照控制箱，規格2.0 m×0.6 m×1.2 m（長×寬×高），箱頂安裝36 W日光燈管1只，箱體外裝一個定時調控開關。羅蘭RETIPort眼科電生理檢查儀（德國），電生理不銹鋼針形電極。丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 實驗用藥：中藥補陰方由當歸10 g、白芍10 g、熟地黃 10 g、山茱萸 10 g、菟絲子12 g、山藥15 g組成，補陽方由熟地黃10 g、續斷15 g、淫羊藿10 g、丹參10 g、巴戟天10 g組成。

1.2 分組與給藥

1.2.1 實驗分組：健康SD大鼠45只，隨機分成3組，即對照組、模型組、中藥組，每組15只。對照組飼養在正常晝夜交替節律的環境中，接受自然光線照射，模型組飼養在光照控制箱內，接受人工光源照射。中藥組飼養在光照控制箱內，接受人工光源照射，大鼠性成熟后予以中藥灌胃。大鼠在箱內可自由飲水和進食，箱內溫度與室溫同，定時調控開關自動控制箱內照明時間，我們設定每日光照“明”（早06∶00至晚24∶00）、“暗”（晚 24∶00 至早 06∶00） 循環交替時間為18 h/6 h，觀察時間為4個月。

1.2.2 中藥組給藥方法：SD大鼠性成熟后，陰道分泌物涂片確定動情周期，動情周期前半期補陰方灌胃，動情周期后半期補陽方灌胃，給藥時間至實驗結束，SD大鼠用藥劑量按成人臨床用量經折算后的劑量〔2〕進行灌胃。

1.3 檢查方法

1.3.1 視覺電生理檢查：實驗至4個月時，各組大鼠進行眼電生理檢查。（1）閃光視網膜電圖（flash electroretinogram，F-ERG）測試：采用不銹鋼針形電極，記錄電極安置在角膜緣，電極盡量與角膜產生最大接觸，參考電極插入耳緣部皮下，地電極插入尾部。記錄國際臨床視覺電生理學會（International Society for Clinical Electrophysiology of Vision，ISCEV）建議的標準 5 項：暗視視桿反應（rod response，Rod-R）、最大混合反應（maximal combined response，Max-R）、振蕩電位（oscillatory potentials，OPs）、明視視錐反應（coneresponse，Cone-R）、30Hz閃爍光（30HzFlicker）。

1.3.2 病理組織學觀察：實驗4個月時，每組隨機取受試大鼠10只，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（50 mg/kg），顳側3點（或9點）位角鞏膜緣縫線標記，頸脫臼法處死大鼠，隨機摘除一側眼球，保留部分視神經，常規固定，石臘包埋，通過視神經及標記線經線方向連續切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察SD大鼠視網膜病理變化。

1.3.3 視網膜過氧化物及抗氧化酶活性測定：實驗4個月時，每組選取受試大鼠5只，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，頸脫臼法處死大鼠，迅速摘除雙側眼球，手術顯微鏡下剝離視網膜，加入生理鹽水300μl，在冰浴中手動勻漿5 min，2500 r/min離心 10 min，取勻漿上清，再用生理鹽水1∶4稀釋待測。硫代巴比妥酸法測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，羥胺法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，考馬斯亮藍法測定蛋白質含量。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 視覺電生理檢查

對照組大鼠引出的F-ERG波形較為典型、分化好，模型組引出的F-ERG波形不典型，主要表現為振幅降低，其中Max-R a、b波振幅顯著下降，下降幅度分別為 54.3%、65.4%；Cone-R a、b波振幅下降，幅度分別為35.8%、38.5%；Ops OP2波振幅（OS2值）、30Hz閃爍光N1-P1振幅下降，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。中藥組大鼠所引出的FERG波形與模型組相似，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），中藥組 Max-R b波較模型組增高， 差異有統計學意義（P＜0.05）（表 1）。

表1 各組大鼠F-ERG振幅比較（，μV）

表1 各組大鼠F-ERG振幅比較（，μV）

注：與對照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＞0.05，③P＜0.05（獨立樣本 t檢驗）

Rod-R Max-R a波 a波對照組 17.25±4.12 94.47±5.21模型組 10.29±2.98① 43.81±4.65①中藥組 13.24±4.13①② 51.17±2.86①②組別b波b波b波45.86±3.9642.67±4.35①39.87±6.31①②256.39±6.3293.25±3.32①124.25±2.82①③Cone-R a波9.34±5.236.24±5.15①6.71±3.15①②52.73±3.8732.25±3.59①39.29±2.91①②Ops OS2 30Hz Flicker N1-P1 90.42±3.87 23.38±4.3467.47±5.03① 8.48±3.54①66.46±5.27①② 10.08±3.14①②

2.2 病理組織學觀察

HE染色光學顯微鏡觀察：對照組視網膜各層間分界清晰，內、外核層細胞核密集，胞核排列整齊規則，內、外叢狀層疏松呈網狀，神經節細胞核大，淡染（圖1A）。模型組視網膜普遍萎縮變薄，層次不清，層數減少，排列紊亂（圖1B）。中藥組與模型組相似（圖1C）。

圖1 各組SD大鼠視網膜光學顯微鏡像（HE ×40）。 1A.對照組：視網膜各層分界清晰，內、外核層排列整齊。1B.模型組：視網膜萎縮變薄，層數減少，排列紊亂。1C.中藥組：視網膜萎縮變薄，層數減少，排列紊亂

2.3 視網膜過氧化物以及抗氧化酶活性分析

對照組大鼠視網膜MDA含量低，SOD活性高，與模型組及中藥組比較差異有統計學意義（P＜0.05），中藥組 SOD活性比模型組高，差異有統計學意義（P＜0.05），MDA含量比模型組低，但差異無統計學意義（P＞0.05）（表 2）。

表2 各組大鼠視網膜MDA、SOD濃度比較（）

表2 各組大鼠視網膜MDA、SOD濃度比較（）

注：MDA濃度：對照組與模型組比較t=23.63，P=0.000；對照組與中藥組比較t=15.41，P=0.01；中藥組與模型組比較t=2.34，P=0.102。SOD濃度：對照組與模型組比較t=38.97，P=0.000；對照組與中藥組比較t=12.01，P=0.001；中藥組與模型組比較t=4.39；P=0.022。MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶

組別 MDA濃度/（nmol/mg蛋白） SOD濃度/（U/mg蛋白）對照組 0.785±6.37 114.325±4.25模型組 2.556±7.15 60.554±5.88中藥組 2.037±6.73 73.317±7.19

3 討論

光照環境的改變對生物節律的影響是目前生命科學研究的熱點〔2〕，生物節律是生物體重要的生命活動，調控著機體生理病理變化，多項動物實驗表明干擾了動物的生物鐘可造成多種損害，而人為調整恢復生物節律可有效地減輕或抵消生物鐘改變帶來的主體節律紊亂的不利影響。國外調整生物節律的對策主要是休息，進行強制光照，或將人分成晨間型和夜間型來安排不同時間的工作。中醫學強調天人相應論，中醫藥在調整生物節律方面有西醫無法替代的優勢。

我院通過長期的臨床和實驗研究總結出調整節律的有效方法，即中醫的陰陽序貫法，該方法已獲取專利，此法源于著名老中醫夏桂成教授半個世紀的臨床經驗，又經談勇教授課題組的深入研究，已形成我院特色療法之一。夏桂成教授立足于“天人相應”觀點，認為人體生物鐘節律是依據日、月節律運動而變化的，并且以日節律為基本單位，人體內陰陽隨十二個時辰的變更消長轉化，繼而擴至月節律，日節律的紊亂可影響月節律，引起生殖周期節律紊亂〔3〕。借鑒這一觀點，王育良教授在實驗中藥組采用陰陽序貫法，意在通過調整大鼠生殖內分泌節律，來調整大鼠的生命主節律，從而減輕或抵消生物鐘改變帶來的不利影響，使機體生理功能穩定。

ERG是評價視網膜功能的客觀檢查方法，廣泛應用于各種視網膜損害疾病的臨床和科學研究。ISCEV建議的標準5項檢查從不同層面反映視網膜功能，對視網膜疾病的定位診斷具有重要的臨床意義，此方案也適用于動物實驗研究。Takahashi T等〔4〕報道54只SD大鼠持續光照24 h和48 h，2周后行ERG檢查，結果顯示Rod-R a、b波振幅，Cone-R b波振幅降低，提示光照可能主要通過損害視錐細胞使視網膜功能下降。本研究中，模型組及中藥組與對照組比較 Max-R a、b波振幅顯著下降，Cone-R a、b波振幅下降，Ops OS2值、30Hz閃爍光N1-P1振幅下降。已知Max-R a波起源于視網膜光感受器和色素上皮細胞，b波起源于視網膜內層；Cone-R起源于視網膜錐體系統；OPs起源于視網膜無長突細胞及視網膜神經節細胞突觸電位；30Hz閃爍光起源于視網膜錐體系統，表明視網膜視錐細胞及視網膜內層功能受損傷。本實驗視覺電生理結果及病理組織學結果與Takahashi T等報道較為一致，可見光是引起視網膜光損傷的主要原因之一。其損傷機制主要有熱損傷、機械損傷和光化學損傷等，其中光化學損傷是最常見的類型，這種損傷的實質是由組織的生物化學和分子生物學變化引起的。我們在結果中還發現中藥組Max-R b波比模型組顯著增高，b波起源于視網膜內層，與視網膜雙極細胞和Müller細胞的電活動有關，考慮中藥可能對視網膜內層有一定的保護作用，但尚需通過大樣本資料深入研究加以證實。

抗氧化物酶SOD可清除體內自由基，因而SOD活性的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力。視網膜丙二醛（MDA）的量常可反映其脂質過氧化的程度，同時也反應了細胞受自由基攻擊的嚴重程度。SOD是視網膜抗氧化系統的主要成份，它可催化超氧化物發生歧化反應生成性質穩定的無毒物質，對于視網膜抵御活性氧分子的氧化攻擊，避免結構損傷，具有重要的意義〔5〕。在實驗中我們發現中藥組與模型組比較SOD活性高，差異有統計學意義，這或許提示中藥通過提高SOD活性，增強了視網膜抵御活性氧分子的氧化攻擊的能力，從而保護視網膜內層，穩定視網膜雙極細胞和Müller細胞的電活動。但中藥組視網膜光鏡觀察與模型組相似，故我們推論光照節律改變可能對視網膜的發育有一定的影響，在大鼠性成熟前我們未予以藥物治療，光照節律改變對視網膜已造成不可逆的損傷，性成熟后予以藥物治療也只能在一定程度上起到保護作用，所以我們認為若根據夏桂成教授調整日節律理論，在光損傷的早期用藥，可能效果更好。中藥是否如上述所示對視網膜有保護作用，其作用位點、作用機制如何，尚需通過大樣本實驗進一步深入研究加以證實。

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