具有非對映選擇性還原6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯活性的微生物菌株篩選與鑒定

毛芳芳， 王亞軍， 羅 希， 魏積福， 鄭裕國

(浙江工業大學 生物工程研究所 生物轉化與生物凈化教育部工程中心，浙江 杭州 310014)

冠狀動脈心臟病是世界上造成死亡最主要的疾病之一。世界衛生組織統計數據顯示，每年死于冠狀動脈心臟病的人數超過760萬。流行病學研究證實冠狀動脈心臟病與高膽固醇血癥有很大的關系。許多降膽固醇藥物被成功開發并上市[1]，其中阿托伐他汀鈣最暢銷，2008年銷售額達到300億美元[2]。6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯是合成阿托伐他汀鈣的關鍵手性前體[3]，傳統的6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯化學合成法不僅使用昂貴的硼烷類試劑和正丁基鋰，而且要在低于-60 ℃的條件下進行反應，消耗大量的能量和有機溶劑[4～6]。

生物轉化與生物催化提供了一種高效、溫和、環境友好、選擇性高的手性合成方法[7]。羰基還原酶普遍存在于細菌、酵母及真菌中，為生物不對稱還原酮酯制備光學純β-羥基酯提供了一條有效的途徑，已成功應用于化學制品、食品、農用化學品和制藥工業等來制備手性醇[8]。然而，大多數天然羰基還原酶催化的不對稱還原都遵守Prelog法則，具有反Prelog法則的立體選擇性羰基還原酶十分稀少，其精確機理也尚不清楚[9]。作者篩選得到一株具有非對映選擇性還原6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯活性的菌株X25 ，對其進行鑒定，并考察了其催化性能。合成機理見圖1。

圖1 羰基還原酶不對稱還原6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯制備6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯

1 實驗

1.1 試劑

6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯標準品，Toronto化學制品研究公司；6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯，浙江新東港藥業股份有限公司；蛋白胨、酵母膏、瓊脂，市售生化試劑；其它試劑均為分析純。

1.2 培養基

富集培養基(g·L-1)：葡萄糖50.0，黃豆芽100.0 (稱取100.0 g黃豆芽，加水煮沸30 min后紗布過濾)，6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯11.4，pH值自然。

斜面培養基(g·L-1)：葡萄糖50.0，黃豆芽100.0 (稱取100.0 g黃豆芽，加水煮沸30 min后紗布過濾)，瓊脂20.0，pH值自然。

發酵培養基(g·L-1)：葡萄糖20.0，酵母膏20.0，NaCl 1.0， KH2PO42.5，(NH4)2HPO42.5，MgSO40.030， 6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯0.2% (體積分數)，pH值7.0。培養基滅菌冷卻后添加6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯，以誘導提高羰基還原酶活性。

酶活定義：在30 ℃、pH值7.0條件下，每分鐘催化生成1 μmol 6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯所需的酶量定義為一個酶活單位。

1.3 菌株的篩選

用于菌株篩選的土樣采集于全國各地。稱取1.0 g土樣，分散到10.0 mL 0.85%(質量濃度)生理鹽水中，移取2.0 mL土壤懸浮液接種至盛有28.0 mL富集培養基的250 mL搖瓶中，28 ℃、150 r·min-1培養至培養基渾濁。移取2.0 mL培養液接種至28.0 mL無菌富集培養基中，在上述條件下培養至培養基渾濁。連續富集3次后稀釋涂固體平板，30 ℃培養至長出清晰的單菌落，挑取單菌落接種至斜面培養基，30 ℃培養36 h后于4 ℃冰箱中保存。

斜面接種于發酵培養基中，30 ℃培養48 h后取20 mL發酵液離心收集菌體檢測還原酶活性。挑選活力和選擇性最好的菌株X25，對其進行分離純化鑒定。鑒定過的菌株用20%(體積分數)甘油保存于-80 ℃低溫冰箱中。

1.4 菌株鑒定

利用Biolog自動微生物鑒定系統考察菌株X25對65種不同碳源的代謝情況。將菌株接種于酵母平板培養基，28 ℃恒溫培養2 d，用無菌棉簽將平板上的菌體轉移并分散于無菌水中，混勻，制成菌懸液，用濁度計調整透光率至47%。分別移取菌懸液至Biolog YT微孔鑒定板，每孔100 μL。將微孔鑒定板放在28 ℃培養箱中，分別培養24 h、48 h和72 h后置于Biolog讀數儀上讀取結果。

分子鑒定首先提取X25的基因組DNA，利用引物pITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和pITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，在PTC-200型PCR儀 (Bio-Rad，USA)上進行擴增。擴增條件如下：95 ℃，4 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，35個循環；72 ℃，10 min。擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒回收目的DNA。根據T/A克隆步驟(Takara，日本)將得到的目的基因與pMD18-T載體連接[10]。將重組的質粒導入感受態E.coliJM109[11]，然后在含有50 μg·mL-1氨卞青霉素的LB平板上生長。將陽性克隆記為E.coliJM109/pMD18-T-X25，并電泳檢測。E.coliJM109/pMD18-T-X25于37 ℃在含有氨卞青霉素的LB平板上培養過夜，收集菌體，用AxyPrep質粒DNA小量試劑盒提取質粒后對基因序列進行檢測。Blast所獲得的序列用于和GenBank 數據庫中的基因序列進行對比。18S rDNA全序列用CLUSTAL W ver.1.81 A軟件包排序，用MEGAversion 2.1軟件包中的 Kimura2-Parameter Distance 模型計算進化距離，用Neighbour-Joining法構建系統發育樹，1000次隨機抽樣，計算自引導值，以評估系統發育樹的置信度。

1.5 轉化條件

取0.5 gP.guilliermondiiX25靜息細胞分散于10 mL含20 g·L-1葡萄糖的磷酸緩沖溶液(pH值7.0，50 mmol·L-1)中，30 ℃預熱2.0 min后加入6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯 (終濃度10 g·L-1)。混勻，于30 ℃反應10 h，轉化過程中每隔2 h取樣0.8 mL，用100 μL HCl滅活，然后用同樣濃度的100 μL NaOH溶液中和，12 000 r·min-1離心10 min，上清液經0.45 μm微濾膜過濾。取澄清濾液測定生成的6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯濃度和殘余6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯濃度。

1.6 分析檢測

6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯、6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯及其非對映異構體用LC-20AD型高效液相色譜儀(島津)檢測。色譜條件為：大連依利特Hypersil ODS2 C18柱 (4.6 mm×250 mm，2.5 μm)，流動相為乙腈-水(1∶3，體積比)，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃。

2 結果與討論

2.1 菌株的鑒定

對篩選得到的菌種進行酶活和非對映選擇性檢測，發現菌株X25作用6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的羰基還原酶活性最強、非對映選擇性最高，產物構型符合反Prelog法則。菌株X25細胞呈卵狀或瓜子狀，細胞大小(1.4～2.5) μm×(1.4～5.0) μm，在平板上形成圓形、乳白色、不透明、中間凸起、表面光滑的菌落(圖2)。Biolog鑒定結果見表1。

由表1可知，菌株X25能夠較好地利用42種碳源，對其它23種碳源不能利用或利用能力較弱。基于Biolog鑒定系統分析結果，菌株X25與PichiaguilliermondiiA標準菌株相似，相似性指數為1.000。

表1 菌株X-25對Biolog YT板上65種碳源的利用能力

注：+，陽性；-，陰性；B，交界。

圖2 菌株X25在豆芽汁平板上的菌落形態

提取菌株X25的18S rDNA，測序后，從Gen-Bank數據庫挑取與X25 18S rDNA 序列相似的序列，并用MegAlign 軟件(DNASTAR公司，美國)繪制進化發育樹(圖3)。將獲得的序列與GenBank中的數據進行相似性分析，結果發現菌株X25與Pichiaguilliermondii(FJ 969194.1)同源性最高 (100%/607 bps，18S rDNA)。因此，菌株X25屬于Pichia屬的Guilliermondii種，中文名稱為季也蒙畢赤酵母。基于生理生化特征與18S rDNA分子鑒定，菌株X25被鑒定為季也蒙畢赤酵母。該菌株保存于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，菌種保藏號CCTCC M 2011386。

圖3 菌株X25的系統進化發育樹

2.2 P.guilliermondii X25發酵動力學

將P.guilliermondiiX25接種于常用畢赤酵母培養基，每隔2 h取樣分析發酵液羰基還原酶活性，結果見圖4。

圖4 培養時間對P.guilliermondii X25生物量、羰基還原酶活性和非對映選擇性的影響

由圖4可知，培養時間對P.guilliermondiiX25羰基還原酶活性、非對映選擇性和生物量影響顯著，培養40 h后，P.guilliermondiiX25 發酵液羰基還原酶活性達到峰值，約24.79 U·L-1。在整個培養進程中，非對映選擇性介于11.7～15.4之間，表明P.guilliermondiiX25具有較好的非對映選擇性。

2.3 溫度、pH值對P.guilliermondii X25靜息細胞羰基還原酶活性的影響

溫度、pH值對P.guilliermondiiX25靜息細胞羰基還原酶活性的影響見圖5。

圖5 溫度(a)、pH值(b)對P.guilliermondii X25靜息細胞羰基還原酶活性的影響

由圖5可知，在溫度22～43 ℃范圍內，P.guilliermondiiX25靜息細胞表現出較好的非對映選擇性，產物de值在90%左右，35 ℃時P.guilliermondiiX25靜息細胞羰基還原酶活性達到最高，約44.3 U·L-1，溫度超過37 ℃時，酶活性急劇下降(圖5 a)；在pH值5.0～8.0范圍內，P.guilliermondiiX25靜息細胞羰基還原酶具有較好的活性和非對映選擇性，在pH值7.0的磷酸緩沖溶液中酶活性最高，達到74.04 U·L-1(圖5b)。

2.4 P.guilliermondii X25非對映選擇性還原6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯

P.guilliermondiiX25非對映選擇性還原6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯進程曲線見圖6。

圖6 P.guilliermondii X25非對映選擇性還原6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯進程

由圖6可知，轉化1 h時，底物6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯轉化率為3.4%，產物6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯de值接近100%；隨著轉化時間的延長，6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯濃度顯著降低，然而6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯de值隨即降至90.4%。這與P.guilliermondiiX25的非對映選擇性介于11.7～15.4之間有關，高的底物轉化率導致低的6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯de值。

3 結論

從自然環境中篩選獲得一株對6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯具有羰基還原酶活性的菌株X25，結合表型特征、生理生化特征和分子遺傳學鑒定，該菌株屬于Pichiaguilliermondii。利用P.guilliermondiiX25靜息細胞成功建立了光學純6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯的生物催化合成工藝，最佳催化條件為35 ℃、pH值7.0；在低底物轉化率時，能夠制備光學純6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯。豐富了他汀類藥物關鍵手性側鏈的合成技術。鑒于P.guilliermondiiX25羰基還原酶的活性和非對映選擇性仍有提升空間，利用現代生物技術對該羰基還原酶進行后續分子改造十分必要。

[1] Pfefferkorn J A,Bowles D M,Kissel W,et al.Development of a practical synthesis of novel,pyrrole-based HMG-CoA reductase inhibitors[J].Tetrahedron,2007,63(34):8124-8134.

[2] Casar Z.Historic overview and recent advances in the synthesis of super-statins[J].Curr Org Chem,2010,14(8):816-845.

[3] Wolberg M,Villela M,Bode S,et al.Chemoenzymatic synthesis of the chiral side-chain of statins:Application of an alcohol dehydrogenase catalysed ketone reduction on a large scale[J].Bioprocess Biosyst Eng,2008,31(3):183-191.

[4] Scheffler J L,Bette V,Mortreux A,et al.Preparation and stereoselective hydrogenation of chiral (4-hydroxy-tetrafuranylidene)carboxylates:A new formal entry to functional anti- and syn-3,5-dihydroxyesters[J].Tetrahedron Lett,2002,43(15):2679-2682.

[5] Everaere K,Franceschini N,Mortreux A,et al.Diastereoselective synthesis of syn-3,5-dihydroxyesters via ruthenium-catalyzed asymmetric transfer hydrogenation[J].Tetrahedron Lett,2002,43(14):2569-2571.

[6] Everaere K,Carpentier J F,Mortreux A,et al.Ruthenium catalyzed asymmetric transfer hydrogenation of beta-ketoesters[J].Tetrahedron-Asymmetry,1998,9(17):2971-2974.

[7] Pfruender H,Amidjojo M,Hang F,et al.Production ofLactobacilluskefircells for asymmetric synthesis of a 3,5-dihydroxycarboxylate[J].Appl Microbiol Biotechnol,2005,67(5):619-622.

[8] Goldberg S,Guo Z W,Chen S,et al.Synthesis of ethyl-(3R,5S)-dihydroxy-6-benzyloxy hexanoates via diastereo- and enantioselective microbial reduction:Cloning and expression of ketoreductase Ⅲ fromAcinetobactersp.SC 13874[J].Enzyme Microb Technol,2008,43(7):544-549.

[9] Nie Y,Xiao R,Xu Y,et al.Novel anti-prelog stereospecific carbonyl reductases fromCandidaparapsilosisfor asymmetric reduction of prochiral ketones[J].Org Biomol Chem,2011,9(11):4070-4078.

[10] Liu Z Q,Sun Z H,Leng Y.Directed evolution and characterization of a novel D-pantonohydrolase fromFusariummoniliforme[J].J Agric Food Chem,2006,54(16):5823-5830.

[11] Chung C T,Niemela S L,Miller R H.One-step preparation of competentEscherichiacoli:Transformation and storage of bacterial cells in the same solution[J].Proc Natl Acad Sci USA,1989,86(7):2172-2175.