β-萘并冠醚卟啉的合成及光敏活性

黃齊茂，李 清，王司衛，潘志權

(武漢工程大學 綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430073)

光動力療法(Photodynamic therapy, PDT)是一種以光、光敏劑和氧的相互作用為基礎的癌癥治療方法[1]。其中光敏劑是光動力療法的關鍵所在[2]，光敏劑對腫瘤組織具有選擇性，可在光照下產生單線態氧殺傷降解腫瘤組織。卟啉類化合物作為應用于PDT治療與診斷的光敏劑，其結構具有剛性，可較好地控制其周邊官能團的方向和位置[3, 4]；冠醚是一種人工合成的受體，分子具有疏水性的外部骨架，又有親水性內腔[5]。因此，作者設計在中位四苯基卟啉的β-位引入冠醚基團，通過對β-(2,3-二羥基萘基)-5,10,15,20-四苯基卟啉進行修飾合成Annulated型[6]冠醚卟啉，并研究了其光敏活性。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

所用試劑和溶劑均用標準方法純化。柱層析硅膠(200～300目，100～120 ℃活化 1 h)，青島海洋化工廠；三羥甲基氨基甲烷-乙酸/鹽酸 (TAE/TBE) 緩沖溶液(pH=7.4，0.05 mol·L-1Tris-HCl，0.1 mol·L-1NaCl)；溴酚藍、溴化乙錠(EB)、瓊脂糖、pBR322質粒DNA，日本Toyobo公司；小牛胸腺DNA(ct-DNA)、1,3-二苯基異苯并呋喃(DPBF)，華美生物工程公司。

Trace GC-MS質譜儀，美國Thermo Finnigan公司；204B型元素分析儀，美國Perkin-Elmer公司；Mercury 300型超導核磁共振儀，美國Varian公司；FTIR-8100型紅外光譜儀、UV-2450型紫外可見分光光度計，日本島津公司；DYY-8B型穩流穩壓電泳儀，南京普陽科學儀器研究所；Lourmat Bio Print-1000型凝膠成像分析系統，法國Vilber公司；高壓汞燈(波長范圍350～800 nm，50 W)，西安教學儀器廠。

1.2 方法

β-(2,3-二羥基萘基)-5,10,15,20-四苯基卟啉的合成參照文獻[7]。β-(2,3-二羥基萘并-9-冠-3)-5,10,15,20-四苯基卟啉合成路線見圖1。

圖1 β-(2,3-二羥基萘并-9-冠-3)-5,10,15,20-四苯基卟啉的合成路線

1.2.1 化合物Ⅲ的合成

稱取200 mg(0.24 mmol)化合物Ⅰ投入100 mL的三口燒瓶中，加入50 mL無水DMF溶解，氬氣保護并電磁攪拌，升溫至100 ℃。取200 mg剛焙燒的碳酸鈉和3 mL(0.24 mmol)雙(2-溴乙基)醚加入反應瓶中，TCL監測反應(展開劑:氯仿∶環己烷=1∶1)，反應約36 h。反應停止后加入50 mL水，抽濾干燥得到固體，用硅膠過柱(淋洗劑:氯仿∶環己烷=1∶3)，收集深紅色主帶第3帶，得紫紅色固體化合物Ⅲ 107 mg，產率48%。UV-Vis(CHCl3),λmax,nm:423,540;IR(KBr),ν,cm-1:3053(ArC-H),2919,2849(C-H),2757,1441(Ar-H),1440,1343(O-H),1176,1072 (C-O),1004 (Cu-N);MS(GC-MS),m/z:904[M+,100]。

1.2.2 化合物Ⅳ的合成

稱取200 mg(0.24 mmol)化合物Ⅱ投入100 mL的三口燒瓶中，其它操作同1.2.1，得紫紅色晶體化合物Ⅳ95 mg，產率44%。UV-Vis(CHCl3),λmax，nm:420,549;1HNMR(300 MHz,CDCl3),δ:8.86～8.52(m,7H,Hβ-pyrrolic),8.23～8.03(m,8H,5,10,15,20-HoPh),7.93～7.25(m,12H,5,10,15,20,HmPh,pPh),7.23～6.46(m,5H,Ar-H),4.71～3.53(m,8H,C-H),-2.59(s,2H,N-H); IR(KBr),ν，cm-1:3412,1278(N-H),2959(ArC-H),2927,2872(C-H),1121,1072(C-O),800,746(Ar-H); MS(GC-MS),m/z:843[M+,100]。

1.3 β-萘并冠醚卟啉產生單線態氧能力的測定

將待測卟啉溶液和DPBF混溶于Tris-HCl緩沖溶液中，使卟啉濃度為1 μmol·L-1、DPBF濃度為100 μmol·L-1。取3 mL混合液于比色皿中，用高壓汞燈照射(距離為20 cm)，用紫外分光光度計測量溶液在415 nm處吸光度值，以光照時間為橫坐標、吸光度為縱坐標作圖，比較其產生單線態氧的能力。

1.4 β-萘并冠醚卟啉切割pBR322質粒DNA的測定

配制1%的瓊脂糖(含0.1%的EB)，制成凝膠。將0.5 μL pBR322質粒DNA分別和0.5 μL不同的冠醚卟啉光敏劑混合，在37 ℃下用高壓汞燈光照2 h (距離為20 cm)，同時做未光照的對照實驗。停止光照后加0.5 μL溴酚藍，在90 V下電泳1.5 h，用凝膠成像分析系統照相。

1.5 β-萘并冠醚卟啉與ct-DNA滴定的紫外可見吸收光譜測定

取3 mLTris-HCl緩沖溶液分別加入到參比池和樣品池中，樣品池中加入3 μmol冠醚卟啉溶液(卟啉濃度為1μmol·L-1) 。用紫外分光光度計記錄隨著ct-DNA濃度的增加，溶液在300～600 nm光譜范圍內的特征吸收峰變化情況。

2 結果與討論

2.1 合成與表征

合成冠醚卟啉的過程中發生了分子內的SN2反應，因此，溶液中加入碳酸鈉作為去酸劑使整個反應體系維持堿性，β-二酚卟啉即可形成芳氧負離子，有利于反應進行。反應前通入高純氬氣除去體系中的氧氣以避免反應原料的氧化。由于目標產物C-O鍵與硅膠的吸附較強且有拖帶現象，故選擇極性較小的展開劑進行分離。當原料為化合物Ⅰ時，第1帶為棕褐色，為少量脫去萘酚的5,10,15,20-四苯基硝基卟啉銅；第2帶為未反應的β-(2,3-二羥基萘基)-5,10,15,20-四苯基卟啉銅；第3帶紅色主帶為目標產物冠醚卟啉銅。當第1和第2帶分離出來后，改用氯仿將第3帶產物淋洗下來，溶液蒸干得到紫紅色固體即為目標產物Ⅲ。

以CDCl3為溶劑的1HNMR圖譜中，δ8.86～8.52歸屬為吡咯環上的氫(7H),δ8.23～7.25歸屬為卟啉中位苯環上的氫(20H)，δ7.23～6.46歸屬為萘基上的氫(5H)，δ4.71～3.53歸屬為冠醚上的氫(8H)，N-H質子化學位移出現在δ-2.59(2H)。紅外吸收光譜中3412 cm-1、1278 cm-1處較強的峰歸屬為N-H伸縮振動峰，2959 cm-1處歸屬為萘酚上的C-H伸縮振動峰，2927 cm-1、2872 cm-1處歸屬為C-H的伸縮振動峰，1121 cm-1、1072 cm-1歸屬為C-O的伸縮振動峰，800 cm-1、746 cm-1處較弱的峰歸屬為Ar-H的彎曲振動峰。

圖2 化合物Ⅲ的高分辨質譜

在高分辨質譜圖(圖2)中，β-(2,3-二羥基萘并-9-冠-3)-5,10,15,20-四苯基卟啉銅的分子離子峰出現在904，豐度為100%；卟啉在脫去銅分子后的分子離子峰出現在843，豐度為30%，與目標產物的理論值相符合。 圖3為化合物Ⅲ的主要離子碎片峰的數據。

圖3 化合物Ⅲ的主要離子碎片峰

2.2 β-萘并冠醚卟啉產生單線態氧的能力

卟啉化合物在光照條件下產生單線態氧產率的高低決定了其光敏能力的大小[8]；DPBF是一種單線態氧捕捉劑。用紫外分光光度計測定卟啉在415 nm處光照不同時間時吸光度的變化，可以判斷卟啉產生單線態氧的能力。化合物Ⅲ、Ⅳ作用下DPBF的分解率見圖4，曲線的斜率代表光敏劑產生單線態氧的能力。

圖4 化合物Ⅲ、Ⅳ作用下DPBF的分解率

從圖4可以看出，化合物Ⅲ、Ⅳ的曲線斜率分別為-0.0024、-0.0080。表明β-(2,3-二羥基萘并-9-冠-3)-5,10,15,20-四苯基卟啉化合物均具有產生單線態氧的能力，其中化合物Ⅲ產生單線態氧的能力相對較弱，這是由于銅是順磁性金屬離子，可明顯降低卟啉反應中氧分子的單線態壽命，導致單線態氧產率降低。化合物Ⅳ比相應化合物Ⅱ的斜率(文獻[7]值為-0.0078)稍高，表明冠醚卟啉具有明顯的產生單線態氧的能力。

2.3 β-萘并冠醚卟啉切割pBR322質粒DNA

圖5為600 μmol·L-1、400 μmol·L-1、200 μmol·L-1、100 μmol·L-1的化合物Ⅳ在光照和無光照的條件下切割超螺旋pBR322質粒DNA的實驗結果。

從圖5可以看出，化合物Ⅳ在光照下對DNA有一定的切割作用，說明冠醚卟啉在光照下產生的單線態氧能夠對DNA產生有效的切割作用，且隨著化合物Ⅳ濃度的增大，對DNA的切割作用逐漸增強，濃度為400 μmol·L-1(條帶 2)切割效果最好, 濃度繼續提高至600 μmol·L-1(條帶 1), 切割效果變化不大。

圖5化合物Ⅳ分別在不同濃度下對超螺旋pBR322DNA的切割

Fig.5CleavageofsupercoiledpBR322DNAbycompoundⅣatdifferentconcentrations

2.4 β-萘并冠醚卟啉與ct-DNA滴定的紫外可見吸收光譜

由于卟啉化合物的獨特結構使其在紫外可見吸收光譜中具有明顯的卟啉特征吸收峰(Soret帶及Q帶)，因此用紫外可見吸收光譜來研究卟啉與DNA的相互作用。

ct-DNA滴定化合物Ⅳ的紫外可見吸收光譜見圖6。

1～8,cDNA(×10-5 mol·L-1):0,2,4,6,8,10,12,14

從圖6可以看出，隨著ct-DNA濃度的增大，化合物Ⅳ的Soret帶出現明顯的減色，減色率為49%，但紅移不明顯(△λ=1 nm)。說明化合物Ⅳ與ct-DNA作用后，卟啉的大環π*共軛體系與DNA堿基的大π共軛體系發生了相互作用，表明卟啉分子主要沿DNA雙螺旋結構表面的自堆積的外部鍵合作用[9～12]。

3 結論

以2,3-二羥基萘基四苯基卟啉及其Cu(Ⅱ)配合物為原料，合成了β-(2,3-二羥基萘并-9-冠-3)-5,10,15,20-四苯基卟啉光敏劑，并檢測了該冠醚卟啉的光敏活性及其與DNA的相互作用。結果表明，β-二羥基萘并冠醚卟啉具有明顯的產生單線態氧的能力；與DNA的相互作用模式為外部自堆積；其對DNA具有較好的光敏切割效果。

[1]Tyrrell Jessica,Campbell Sandra M,Curnow Alison.Monitoring the accumulation and dissipation of the photosensitizer protoporphyrin Ⅸ during standard dermatological methyl-aminolevulinate photodynamic therapy utilizing non-invasive fluorescence imaging and quantification[J].Photodiagnosis and Photodynamic Therapy,2011,8(1):30-38.

[2] Ma X,Tian H.Bright functional rotaxanes[J].Chem Soc Rev,2010,39(1):70-80.

[3] Sirish M,Schneider H J.Porphyrin derivatives as water-soluble receptors for peptidest[J].Chem Common,1999,(10):907-908.

[4]Ethirajan M,Chen Y H,Joshi P,et al.Fluorescent micelles based on star amphiphilic copolymer with a porphyrin care for bioimaging and drug delivery[J].Chemical Society Reviews,2011,40(1):340-362.

[5]劉海洋,黃錦江,彭斌,等.金屬卟啉配合物的分別識別研究進展[J].無機化學學報,1997,13(3):1-10.

[6]Pascale Even,Bernard Boitrel.Crown porphyrins[J].Coordination Chemistry Reviews,2006,250(3-4):519-541.

[7]黃齊茂,李志遠,肖欣,等.新型β-二酚卟啉光敏劑合成及其與DNA作用[J].有機化學,2010,30(1):79-84.

[8]Yapar G,Erk C.A study of the metal complexing of naphthalene-2,3-crown ethers using fluorescence spectroscopy.Part Ⅲ[J].Dyes and Pigments,2001,48(3):173-177.

[9]DeFedericis H C,Patrzyc H B,Rajecki M J,et al.Singlet oxygen induced DNA damage[J].Radiat Res,2006,165(4)：445-451.

[10] Li Z G,Yang Q,Qian X H.Novel thiazonaphthalimides as efficient antitumor and DNA photocleaving agents:Effects of intercalation side chains,and substituent groups[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry,2005,13(16):4864-4870.

[11] 宋存牛.超聲波激活血卟啉抗腫瘤效應機理研究[J].陜西師范大學學報(自然科學版),2002,20(2):38-40.

[12] 朱隆懿,孫羽,王倩，等.金屬卟啉對雜環及DNA分子識別的研究進展[J].有機化學,2009,29(11):1700-1707.