雙甘膦修飾磁性四氧化三鐵納米微球吸附DNA的研究

孫 群，李步海

(中南民族大學化學與材料科學學院 國家民委分析化學重點實驗室，湖北 武漢430074)

從生物樣品中提取核酸是分子生物學和臨床醫學等生命科學研究領域中的一項基本技術。核酸提取的傳統方法有PEG沉淀法、CsCl超速離心法、離子交換樹脂法、煮沸裂解法和堿裂解法等[1]。這些方法往往耗時長、使用有毒的試劑且提取的DNA純度不高。人們期望研發一種簡易高效的質粒DNA提取方法。其中,用表面修飾的磁性粒子作為載體,利用磁性材料在外磁場下易于相分離的特點，可望成為一種有潛力的方法。磁性微粒作為一種新型的基質,可以進一步簡化和加速核酸的分離與純化過程，實現核酸純化處理的微型化、自動化和平行化[2,3]。

各種修飾磁性微粒的應用發展迅速，比如在磁性微粒表面連接NTA-Ni2+分離蛋白質、核酸等，或者在表面連接膦酸[4,5]，利用其易修飾性、特殊化學特點和物理惰性，保護內部結構并避免外部環境的干擾[6]，而在磁性微球表面連接雙甘膦(PMIDA)可以有效減少磁場條件下的結塊，從而增加羧基的數量[7]，更有利于連接金屬離子，達到吸附核酸的目的。該方法簡便快速，吸附分離效果好，有實際應用價值。作者在此用雙甘膦修飾磁性四氧化三鐵納米微球(MNP)并負載Zn2+后用于提取DNA，并考察了相關因素的影響。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

小牛胸腺DNA，Sigma-Aldrich試劑公司；雙甘膦(PMIDA)，阿拉丁試劑公司；FeCl2·4 H2O，廣東臺山眾城化工有限公司；濃氨水；FeCl3·6H2O，國藥集團化學試劑有限公司；ZnSO4·7H2O，杭州蕭山化學試劑廠。所用試劑均為分析純。實驗用水為去離子水。

UV2300Ⅱ型紫外可見分光光度計，上海天美科學儀器有限公司；SHZ-03型恒溫水浴搖床，上海堪鑫儀器設備有限公司；TGL-16G型臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；Gene Genius & Gene Gnome型Gene Genius成像系統，Synoptics Ltd.；PAC3000型超聲儀。

1.2 方法

1.2.1 DNA標準溶液的配制

將小牛胸腺 DNA溶于 10 mL 10% NaCl溶液中得到濃度為 1.461 g·L-1的DNA標準溶液(經紫外光譜測定260 nm處吸收值后，通過經驗公式cDNA=50A260計算溶液DNA濃度)。

1.2.2 磁性四氧化三鐵納米微球的制備

稱取FeCl2·4 H2O 2.17 g、 FeCl3·6H2O 5.26 g,溶于100 mL去離子水中，在N2氛圍下加熱至60 ℃，攪拌下緩慢滴加12 mL濃氨水，持續反應1 h，冷卻至室溫,磁場分離。用去離子水洗3～4次，60 ℃真空干燥4 h，得到磁性四氧化三鐵納米微球(MNP)。

1.2.3 PMIDA-Zn2+修飾磁性微球的制備

(1)PMIDA修飾磁性微球：稱取0.232 g(1 mmol)MNP于去離子水中超聲分散20 min，再加入3.5 mmol的PMIDA,在室溫下反應12 h，并用1.25 mol·L-1的NaOH溶液調節pH值為10。反應結束后磁場分離，用去離子水洗3～4次，洗滌液與上清液合并，用于測定磁性微球已修飾PMIDA的量；固體在60 ℃下真空干燥4 h，即得PMIDA修飾磁性微球。

(2) PMIDA-Zn2+修飾磁性微球：向0.1 g PMIDA修飾磁性微球中加入0.1 mol·L-1的ZnSO4·7H2O 溶液15 mL，常溫下振蕩。反應結束后磁場分離，用去離子水洗至上清液無Zn2+，60 ℃真空干燥4 h，即得PMIDA-Zn2+修飾磁性微球。

1.2.4 磁性微球已修飾PMIDA的量的測定

參考文獻[8]，用濃硫酸消解法測定反應后上清液及洗滌液中剩余PMIDA的量。磁性微球已修飾PMIDA的量=修飾前加入PMIDA的量-修飾后上清液及洗滌液中剩余PMIDA的量。

1.2.5 吸附與洗脫實驗

1.2.5.1 吸附

分別稱取10 mg吸附劑(PMIDA-Zn2+修飾磁性微球)于離心管中,各加入濃度為1.461 g·L-1的DNA標準溶液50 μL和不同pH值的緩沖溶液 1.0 mL,渦旋混勻，室溫下溫和振搖20 min，磁場分離，吸出上層清液0.85 mL并用去離子水稀釋4倍 ,用紫外可見分光光度計測定260 nm處的吸光度。

1.2.5.2 洗脫

取10 mg已吸附DNA的吸附劑，加入不同濃度的氨水，渦旋混勻后靜置10 min，磁場分離磁性微球,吸取洗脫液用于核酸的紫外測定。

1.2.6 玉米DNA的提取

玉米基因組的提取方法參考文獻[9] 。具體步驟為：取液氮下研磨過的玉米1.5 g,加入到含3.0 mL細胞裂解液( 0.1 mol·L-1Tris-HCl , 0.05 mol·L-1EDTA, 0.5 mol·L-1NaCl，pH值8.0)的10 mL離心管中，再加入10%十二烷基硫酸鈉(SDS)500 μL。65 ℃水浴處理30 min,5000 r·min-1離心,得到1.5 mL細胞裂解清液。移取0.4 mL裂解清液于10 mg磁性微球中,渦旋5 s。再加入核酸吸附液( 20% PEG-8000，2 mol·L-1NaCl，pH值5.0) 1.0 mL,渦旋混勻,35 ℃振蕩20 min。磁場下分離并棄去上層清液。用80%異丙醇和70%乙醇1.0 mL洗滌磁性微球各2次。吹干乙醇后,加入TE緩沖溶液 (10 mmol·L-1Tris-HCl,1 mmol·L-1EDTA , pH值7.8)200 μL,渦旋混勻，靜置10 min，磁場下分離磁性微球,吸取洗脫液150 μL，向吸附劑中加入TE緩沖溶液200 μL重復解吸1次，合并洗脫液，稀釋至1 mL，紫外檢測提取的DNA。吸附劑中剩余的洗脫液進行凝膠電泳分離實驗。

電泳條件：取樣品溶液10 μL與1 μL溴酚藍溶液于TAE緩沖溶液(0.04 mol·L-1Tris-CH3COOH , 0.001 mol·L-1EDTA，pH值8.0)中上樣，10%瓊脂糖凝膠電泳(150 V，30 min)。

2 結果與討論

2.1 磁性微球已修飾PMIDA的量

測定結果表明，磁性微球表面PMIDA的結合量為546.5 mg·g-1,證明PMIDA已修飾到磁性納米微球上。

2.2 DNA吸附的影響因素

2.2.1 pH值

圖1 pH值對DNA吸附率的影響

2.2.2 離子強度

圖2 離子強度對DNA吸附率的影響

固定吸附時間為20 min、pH值為5.0，其它條件同2.2.1，考察離子強度(NaCl濃度)對DNA吸附的影響，結果如圖2所示。 由圖2可知，隨著離子強度的增大，吸附率逐漸升高；但離子強度超過2.0 mol·L-1后，吸附率基本不變。因此，確定適宜的離子強度為2.0 mol·L-1。

2.2.3 吸附時間

固定NaCl濃度為2.0 mol·L-1，其它條件同2.2.2，考察吸附時間對DNA吸附的影響，結果如圖3所示。

圖3 吸附時間對DNA吸附率的影響

由圖3可知，在吸附初期，由于修飾磁性微球上的吸附位點較多，吸附率上升較快；隨著吸附的進行，吸附位點變少至達到平衡；吸附20 min后，吸附率幾乎不變。因此，確定適宜的吸附時間為20 min。

2.2.4 吸附溫度

固定NaCl濃度為2.0 mol·L-1，其它條件同2.2.2，考察吸附溫度對DNA吸附的影響，結果如圖4所示。

圖4 吸附溫度對DNA吸附率的影響

由圖4可知，在0～40 ℃范圍內，吸附率隨著吸附溫度的升高而上升。這是因為，吸附溫度升高，溶液中分子熱運動加劇，吸附率上升。考慮到動物體內DNA存在的環境，確定適宜的吸附溫度為35 ℃。

2.2.5 吸附劑用量

在吸附劑用量為10 mg、pH值為5.0、NaCl濃度為2.0 mol·L-1、吸附溫度為35 ℃、吸附時間為20 min的條件下，DNA吸附率可達80%，且隨著吸附劑用量的增加而上升，當吸附劑用量為30 mg時，吸附率達到100%。這是因為，所用吸附劑越多，對一定濃度DNA的吸附越完全，因此，在實際使用時，應根據溶液中DNA濃度選擇適當的吸附劑用量，以保證吸附完全。

2.2.6 DNA濃度

確定吸附劑用量為10 mg、pH值為5.0、NaCl濃度為2.0 mol·L-1、吸附溫度為35 ℃、吸附時間為20 min，測定吸附劑對不同初始濃度DNA的吸附容量，繪制DNA的吸附等溫線，見圖5。

圖5 DNA的吸附等溫線

由圖5可知，吸附劑對DNA的吸附容量隨著DNA初始濃度的增大而增大；當DNA初始濃度超過一定值后，DNA吸附容量變化不大。

吸附容量是判斷吸附性能的一個重要指標。分別用Langmuir和Freundlich吸附模型對吸附等溫線進行擬合，Langmuir和Freundlich吸附等溫線模擬圖和模擬參數分別見圖6、表1。

圖6 DNA的Langmuir吸附等溫線模擬圖(a)和Freundlich吸附等溫線模擬圖(b)

表1 DNA的Langmuir和Freundlich吸附等溫線模擬參數

由圖6和表1可知，Langmuir模型和Freundlich模型的相關系數分別為0.9755和0.9212，表明PMIDA-Zn2+修飾磁性微球對DNA的吸附更符合Langmuir吸附模型，其理論最大吸附容量為26.27 mg·g-1，與實驗值21 mg·g-1基本吻合。

2.3 DNA的洗脫

以氨水洗脫被吸附的DNA，氨水濃度對DNA洗脫的影響見圖7。

圖7 氨水濃度對DNA洗脫的影響

2.4 吸附劑提取玉米中DNA

以洗脫液A260/A280的比值表示提取后DNA的純度，紫外測定該比值為1.6382，說明提取的DNA純度較高，進一步計算其濃度為333.800 μg·mL-1。

洗脫液對應的10%瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖8所示。圖8中出現較明顯的DNA譜帶，證明DNA已提取并洗脫下來，且純度較高。

2.5 討論

實驗采用固相吸附的方法,以直接研磨玉米面的方法將玉米細胞壁打破,之后加入一定量的細胞提取液,參考文獻[9],向吸附液中加入20%PEG后，在PEG與 NaCl共同作用下將 DNA吸附到磁性微球表面 ,選擇性迅速提高，因為DNA的脫水作用是 DNA析出的主要動力[10，11]，用 TE緩沖溶液將 DNA洗脫下來結果較理想。

1，2.洗脫液平行2次進樣 M.DNA Mark

3 結論

用雙甘膦(PMIDA)修飾磁性四氧化三鐵納米微球(MNP)并負載Zn2+后用于提取DNA。當吸附劑用量為10 mg、pH值為5.0、離子強度(NaCl濃度)為2.0 mol·L-1、吸附時間為20 min、吸附溫度為35 ℃時，DNA吸附率達80%、吸附容量為21 mg·g-1。在低pH值、高濃度的鹽存在下,DNA的磷酸基團與基質螯合的Zn2+靜電結合，能大大提高PMIDA-Zn2+修飾磁性微球對DNA的吸附率。在氨水濃度為3.5%時，DNA能從吸附劑表面完全洗脫下來, 從而達到分離純化的目的。用制備的吸附劑從玉米中提取DNA,提取純度較高(A260/A280=1.6382)。此方法簡便快速，所得DNA純度較高，效果令人滿意。

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