高純度阿扎霉素 B的分離純化工藝研究

朱秀良，王海燕，李 寧，林 毅，張雪霞，李曉露

(微生物藥物國家工程研究中心 河北省工業微生物代謝工程技術研究中心華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司，河北 石家莊 050015)

阿扎霉素B是一種從鏈霉菌(Streptomycesmelanosporus)培養液中分離出的具有對稱性的十六元環大環雙內酯抗生素, 分子式C54H88O18，相對分子質量1025，為白色針狀或雪花狀結晶，在空氣中較易失去溶劑而呈無定形粉末。在純溶劑中溶解度小，溶于甲醇、氯仿、乙醇、乙酸乙酯，微溶于丙酮，不溶于苯、醚、水，易溶于混合溶劑。阿扎霉素B的結構式見圖1。

圖1 阿扎霉素B的結構式

阿扎霉素B具有大環內酯抗生素抗菌的典型特征，對枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌、白喉棒狀桿菌、破傷風芽孢桿菌均有抑制作用[1]；具有良好的治療線蟲感染等作用，是抗寄生蟲藥研究熱點之一；能有效提高瘤胃中丙酸產量，是一種有發展前景的牛類生長促進劑[2]；具有免疫抑制作用，可能成為強免疫抑制劑[3]。

目前，國內外關于阿扎霉素B分離純化的報道較少,且已有的制備方法存在工藝復雜、溶媒消耗量大、所得產品純度不高、收率低等缺點[3～5]。作者采用大孔樹脂對阿扎霉素B粗粉進行分離純化，對樹脂類型、洗脫條件和上樣量進行了優化。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

阿扎霉素B發酵液，華北制藥集團新藥公司；阿扎霉素B標準品(純度≥98.5%)，自制；大孔樹脂HZ816、HZ801，上海華震科技有限公司；大孔樹脂AB-8、D312，安徽三星樹脂科技有限公司；大孔樹脂XAD1600，羅門哈斯公司；乙腈，色譜純，美國Merck公司；乙醇，工業級，滄州興隆化工有限公司；其它試劑均為國產分析純；超純水，自制。

高效液相色譜儀(996檢測器，515泵)，Waters公司；Loborata 4000型旋轉蒸發器，Heidolph公司；TGL-16G高速離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm,5μm)；流動相：乙腈-水(55∶45，體積比)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：254 nm；進樣量：10μL。

阿扎霉素B保留時間為11.3 min，以阿扎霉素B標準品為參照。

1.3 阿扎霉素B粗粉的制備

阿扎霉素B發酵液經真空抽濾，水頂洗，得菌絲體；然后加入4 BV工業乙醇攪拌浸泡2 h，真空抽濾，得阿扎霉素B浸提液；浸提液減壓濃縮除去乙醇，以乙酸乙酯為萃取溶劑，萃取3次，合并萃取液；加入萃取液體積1%的活性炭脫色，石棉板過濾，濾液減壓濃縮、結晶、干燥，得阿扎霉素B粗粉。所得粗粉產品純度為80%左右，粗提收率大于90%。

1.4 阿扎霉素B粗粉的分離純化

1.4.1 樹脂的預處理及再生

先用乙醇充分浸泡樹脂，除去致孔劑、色素和雜質，用水反復洗滌至洗滌液加乙醇后無白色渾濁；然后用2 mol·L-1的鹽酸溶液攪拌浸泡4 h，水洗至中性；再用2 mol·L-1的氫氧化鈉溶液攪拌浸泡4 h，水洗至中性，備用。再生方法與預處理基本相同。

1.4.2 層析樹脂的選擇

分別用預處理好的HZ816、HZ801、D312、AB-8和XAD1600樹脂100 mL裝柱，將1.0 g阿扎霉素B粗粉用乙醇-水溶解后上樣于層析柱，依次用20%(體積分數，下同)、70%的乙醇洗脫，洗脫速度為2.0 mL·min-1，分管收集洗脫液，HPLC檢測，將阿扎霉素B純度大于95%的洗脫液合并，計算層析收率。

1.4.3 洗脫液濃度的選擇

將1.0 g阿扎霉素B粗粉用乙醇-水溶解后上樣于100 mL HZ816層析柱，先用20%的乙醇洗下極性大的雜質，再分別用60%、70%、80%的乙醇進行洗脫，洗脫速度為2.0 mL·min-1，分管收集洗脫液，HPLC檢測，將阿扎霉素B純度大于95%的洗脫液合并，計算層析收率。

1.4.4 洗脫速度的選擇

將1.0 g阿扎霉素B粗粉用乙醇-水溶解后上樣于100 mL HZ816層析柱，先用20%的乙醇洗下極性大的雜質，再用70%的乙醇洗脫，洗脫速度(mL·min-1)分別為1.0、1.5、2.0、2.5和3.0，分管收集洗脫液，HPLC檢測，將阿扎霉素B純度大于95%的洗脫液合并，計算層析收率。

1.4.5 上樣量的選擇

分別將0.5 g、0.75 g、1.0 g、1.5 g、2.0 g阿扎霉素B粗粉用乙醇-水溶解后上樣于100 mLHZ816層析柱，依次用20%、70%的乙醇洗脫，洗脫速度2.0 mL·min-1，分管收集洗脫液，HPLC檢測，將阿扎霉素B純度大于95%的洗脫液合并，計算層析收率。

2 結果與討論

2.1 層析樹脂的選擇

考察了5種大孔樹脂對阿扎霉素B粗粉的層析分離效果，結果見表1。

表1 不同型號樹脂的層析收率

由表1可知，HZ816和XAD1600兩種樹脂對阿扎霉素B的層析效果較好，層析收率較高，但XAD1600樹脂為進口樹脂，價格昂貴。因此，選定HZ816樹脂為阿扎霉素B粗粉的層析樹脂。

2.2 乙醇體積分數的選擇(表2)

表2 乙醇體積分數對層析收率的影響

由表2可知，當用體積分數為60%的乙醇洗脫時，洗脫液體積大，洗脫不集中；而用體積分數為80%的乙醇洗脫時，洗脫雖集中，但雜質也同時被洗下，層析收率有所下降。綜合洗脫效果和層析收率，選擇乙醇的體積分數為70%。

2.3 洗脫速度的選擇(圖2)

圖2 洗脫速度對層析收率的影響

由圖2可知，洗脫速度過慢，洗脫不集中，層析收率偏低；而洗脫速度過快，有效組分與雜質組分得不到有效分離，層析收率也不高；洗脫速度為2.0 mL·min-1時，阿扎霉素B的層析收率最高。因此，選擇洗脫速度為2.0 mL·min-1。

2.4 上樣量的選擇(表3)

表3 上樣量對層析收率的影響

由表3可知，上樣量過低，樣品分散較嚴重，層析收率偏低；隨著上樣量的增加，層析收率有所上升；但上樣量過多，會導致層析柱過載，造成阿扎霉素B與雜質的重疊，層析收率反而下降；當上樣量為1.0 g即0.01 g·(mL樹脂)-1時，HZ816樹脂的層析收率最高。因此，選擇上樣量為0.01 g·(mL樹脂)-1。

2.5 驗證實驗

取預處理好的HZ816樹脂500 mL裝柱，將5.0 g阿扎霉素B粗粉用乙醇-水溶解后上樣于HZ816層析柱，依次用20%、70%的乙醇洗脫，洗脫速度為1 BV·h-1樹脂床體積,分管收集洗脫液，HPLC檢測，合并阿扎霉素B純度大于95%的洗脫液，減壓濃縮、萃取、結晶、干燥，得阿扎霉素B精粉，結果見表4。

由表4可知，各批次所得產品純度均大于95%，層析收率大于72%，過程總收率大于60%。

表4 不同批次阿扎霉素B分離純化結果(n=3)

3 結論

研究了大孔樹脂層析分離阿扎霉素B的工藝過程，對樹脂類型、洗脫條件和上樣量進行了優化。結果表明，HZ816樹脂為最佳層析介質，上樣量為0.01 g·(mL樹脂)-1，洗脫劑為體積分數70%的乙醇，洗脫速度為1 BV·h-1樹脂床體積。按此工藝所得產品純度大于95%，過程總收率大于60%。該方法簡單易行、成本低、收率高，適宜工業化生產。

[1] 嚴淑玲，黃為一.阿扎霉素B(Azalomycin B)研究進展[J].微生物學通報，2002,29(5)：103-107.

[2] Chao-Miay L,Westley J.Elaiophylin as a rumen fermentation efficiency enhancer[J].Antibiotics,1993,46(2):350-352.

[3] Lee S Y,Kim H S,Kim Y H,et al.Production of elaiophylin by the strain MCY-846 in a submerged culture[J].J Microbiol Biotechnol,1997,7(4)：272-281.

[4] Alvi Ka,Peterson J,Hofmann B.Rapid identification of elaiophylin and geldanamycin inStreptomycesfermentation broths using CPC coupled with a photodiode array detector and LC-MS methodologies[J].J Ind Microbiol,1995,12(2)：80-84.

[5] 江曙，黃為一.阿扎霉素B提取純化工藝的優化[J].生物技術，2008，18(4)：74-76.