脫二氧喹烯酮多克隆抗體的制備及其直接競爭ELISA檢測方法的建立

曹 娟，傅堅英，王延英，張吉斌

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，湖北 武漢430070)

喹烯酮[1](Quinocetone)是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所研制的畜禽抗菌、止瀉、促生長新藥，為我國首創(chuàng)，是喹口惡啉類化合物的一種。喹烯酮除了具有喹口惡啉類藥物抗菌、促生長作用的特點外，還具有高效、低毒和添加量少等優(yōu)點[2]。喹烯酮雖屬高效、安全的飼料添加劑，但作為獸藥使用時，仍需考慮其通過食物鏈對人體可能產(chǎn)生的不良影響，所以有必要建立其食用動物組織殘留量的檢測方法并明確規(guī)定其殘留限量。

目前，喹烯酮及其代謝物的檢測主要集中在喹烯酮原料藥及其預(yù)混劑和動物組織中的殘留。采用的檢測方法主要有高效液相色譜法[3]、薄層色譜法[4]和紫外分光光度法[5]，這些方法靈敏、準(zhǔn)確，但費時費力，成本高，設(shè)備昂貴，需要專業(yè)人員操作，有一定的局限性。以免疫抗體為基礎(chǔ)的免疫檢測技術(shù)，克服了儀器分析的局限，是一類快速、操作簡單的分析方法，在農(nóng)藥、獸藥和毒素等小分子物質(zhì)檢測中應(yīng)用廣泛。喹口惡啉類藥物中喹乙醇[6]和卡巴氧[7]的毒性較大，免疫分析檢測一般集中在這兩種藥物上，迄今為止，用酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)檢測喹烯酮重要代謝標(biāo)志物脫二氧喹烯酮(DQCT)[8]殘留尚未見報道。

作者在此首次利用脫二氧喹烯酮制備人工抗原得到了高效價的多克隆抗體，并用過碘酸鈉氧化法制備了辣根過氧化物酶標(biāo)記抗原(DQCT-OVA-HRP)，通過對間接競爭ELISA (IC-ELISA)和直接競爭ELISA(DC-ELISA)進(jìn)行比較，最終建立了檢測DQCT的直接競爭ELISA法，并確定了靈敏度和檢測范圍，為實際樣品的檢測打下基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

實驗動物Balb/C雌性小鼠，湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、碳二亞胺(EDC)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，Sigma公司；脫二氧喹烯酮(DQCT)，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG(HRP-IgG)，美國Pierce公司；四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，BIOSHARP公司；4-二甲氨基吡啶(DMAP，含量≥98%)，北京化工廠。

ELX800型酶標(biāo)儀，BIO-TECH公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫原(DQCT-BSA)的制備

(1)DQCT的肟化[9]

將5.5 mg DQCT 溶于500 μL無水丙酮，加入2.2 mg DMAP[10]、4.38 mg羧甲基羥胺半鹽酸鹽，50 ℃攪拌反應(yīng)30 min，N2吹干丙酮；殘余物用1～2 mL乙酸乙酯溶解，加適量水洗3～4次，取乙酸乙酯層，N2吹干。

(2)與BSA的偶聯(lián)(混合酸酐法)

取2.95 mg上述反應(yīng)產(chǎn)物用200 μLN，N-二甲基甲酰胺攪拌溶解后，加入3 μL三乙胺，4 ℃下反應(yīng)1 h；加入9 μL氯甲酸異丁酯，繼續(xù)反應(yīng)1 h；將反應(yīng)好的產(chǎn)物緩慢滴加到6.4 mg BSA(溶于423 μL 0.1 mol·L-1NaHCO3)中，4 ℃反應(yīng)過夜；將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入透析袋，4 ℃攪拌下透析3 d，前2 d用0.01 mol·L-1PBS透析，第3 d用蒸餾水透析；分裝冷凍干燥，-20 ℃保存。

1.2.2 包被原(DQCT-OVA)的制備

(1)DQCT的肟化[11]

將5 mg DQCT 溶于1.18 mL無水乙醇，與2.6 mg鹽酸羥胺(溶于400 μL超純水)混合，冰浴下反應(yīng)2.5 h，其間滴入0.05 mol·L-1NaOH溶液約411 μL；反應(yīng)后滴入醋酸鹽緩沖溶液約300 μL，并加入少量碎冰，出現(xiàn)淡黃色沉淀，4 ℃下靜置l d。

(2)酰化

將上述反應(yīng)液于10 000 r·min-1離心10 min，棄上清液；沉淀用1 mLN，N-二甲基甲酰胺溶解后，加入3 mg琥珀酸酐，室溫反應(yīng)2 h；隨后加入三乙胺50 μL，繼續(xù)反應(yīng)1 h。

(3)與OVA的偶聯(lián)(碳二亞胺法)

將反應(yīng)好的酰化產(chǎn)物滴加到15 mg OVA(溶于2 mL 0.1 mol·L-1NaHCO3)中，加入4 mg EDC，反應(yīng)1 h后，再加2 mg EDC，暗處攪拌反應(yīng)過夜；4 ℃透析3 d，冷凍干燥，-20 ℃保存。

1.2.3 酶標(biāo)抗原(DQCT-OVA-HRP)的制備

取3 mg HRP溶于0.3 mL蒸餾水中，加入新配制的0.06 mol·L-1NaIO4溶液0.3 mL，4 ℃反應(yīng)30 min，加入0.16 mol·L-1乙二醇溶液0.3 mL，室溫反應(yīng)30 min；加入3 mg DQCT-OVA (溶于0.6 mL PBS)，混勻后裝入透析袋，用0.05 mol·L-1pH值9.5的碳酸鹽緩沖溶液緩慢攪拌透析過夜；加入5 mg·mL-1NaBH4溶液0.12 mL，4 ℃反應(yīng)2 h；用飽和硫酸銨法進(jìn)行純化，分裝，-20 ℃保存[12]。

1.2.4 動物免疫

取6～8周齡的雌性Balb/C小鼠，免疫原DQCT-BSA稀釋后與等體積的弗氏完全佐劑混合，充分混勻至乳化完全。采用腹腔加皮下多點注射免疫方式，劑量為每只100 μg。以后每隔2周加強免疫1次，用與初次免疫等劑量的免疫原與弗氏不完全佐劑等體積充分乳化后注射，免疫4次。免疫7 d后眼球采血，制備抗血清，通過間接ELISA法測抗體效價及特性[13]。

1.2.5 最佳包被原濃度和抗體稀釋度的確定

將包被原以濃度50 μg·mL-1、20 μg·mL-1、10 μg·mL-1、5 μg·mL-1、2.5 μg·mL-1、1.25 μg·mL-1包被，抗血清按1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000梯度稀釋，采用間接ELISA 法和方陣滴定法優(yōu)化包被原和抗血清的工作濃度。

1.2.6 多克隆抗體效價的測定

以未免疫Balb/C小鼠的血清作為陰性對照，將經(jīng)過免疫的Balb/C小鼠血清梯度稀釋 (1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000)。用最佳包被原濃度包被酶標(biāo)板，采用間接ELISA法檢測，TMB底物顯色，分別測定陽性血清和陰性血清的OD450，陽性血清的A450/陰性血清的A450(P/N)≥2.1時抗體的最大稀釋倍數(shù)即為該抗體的效價。

1.2.7 間接競爭ELISA法

將包被原DQCT-OVA稀釋為5 μg·mL-1，以每孔100 μL包被酶標(biāo)板4 ℃過夜。加入200 μL 2% OVA封閉，再加入50 μL抗血清和50 μL DQCT標(biāo)準(zhǔn)品，37 ℃孵育1 h；加入100 μL HRP-IgG，37 ℃孵育1 h；加入TMB底物顯色15 min后，再加入50 μL 2 mol·L-1H2SO4終止，測定OD450值。以上步驟除去加底物顯色及硫酸終止后無需洗板，其它步驟孵育完成后均用PBST洗板3次。

1.2.8 直接競爭ELISA法

將多克隆抗體稀釋一定倍數(shù)后，以每孔100 μL包被酶標(biāo)板過夜。加入200 μL 2% OVA,37 ℃封閉1 h；再加入50 μL DQCT標(biāo)準(zhǔn)品和50 μL酶標(biāo)抗原DQCT-OVA-HRP，37 ℃孵育1 h；加入底物顯色15 min，再加入50 μL 2 mol·L-1H2SO4終止，測定OD450值。以上步驟除去加底物顯色及硫酸終止后無需洗板，其它步驟孵育完成后均用PBST洗板3次。

1.2.9 多克隆抗體靈敏度和特異性的測定

將酶標(biāo)抗原DQCT-OVA-HRP稀釋不同倍數(shù)，進(jìn)行方陣滴定，確定直接競爭ELISA法中抗DQCT多克隆抗體和DQCT-OVA-HRP的最佳工作濃度。在兩種檢測方法的最佳工作濃度下，用二甲基亞砜將DQCT標(biāo)準(zhǔn)品配制成10 mg·mL-1的溶液，再用甲醇稀釋成不同濃度(1000 μg·mL-1、100 μg·mL-1、10 μg·mL-1、1 μg·mL-1、0.1 μg·mL-1、0.01 μg·mL-1)標(biāo)準(zhǔn)液，分別用間接競爭ELISA法和直接競爭ELISA法測定，比較靈敏度。

以不同濃度(1000 μg·mL-1、100 μg·mL-1、10 μg·mL-1、1 μg·mL-1、0.1 μg·mL-1、0.01 μg·mL-1)的喹烯酮、脫二氧喹烯酮羰基還原物、喹賽多、脫二氧喹賽多、乙酰甲喹替代DQCT，采用直接競爭ELISA法檢測，分別計算各自的交叉反應(yīng)率。

2 結(jié)果與討論

2.1 DQCT人工抗原的鑒定

2.1.1 DQCT-BSA的MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果

將DQCT-BSA偶聯(lián)物用超純水溶解成濃度為1～3 mg·mL-1的樣品，進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定，結(jié)果見圖1。

圖1 BSA(a)和DQCT-BSA(b)的MALDI-TOF-MS圖譜

由圖1可知，BSA的分子量為66.481 kDa，DQCT-BSA偶聯(lián)物的分子量為70.200 kDa，根據(jù)偶聯(lián)比計算公式[14]：偶聯(lián)比=(M偶聯(lián)物-M蛋白)/M半抗原，計算得DQCT-BSA的偶聯(lián)比為11.3。偶聯(lián)比較高，可以用作動物免疫。

2.1.2 DQCT-OVA的紫外掃描鑒定結(jié)果(圖2)

圖2 OVA、DQCT-OVA的紫外吸收圖譜

由圖2可知，DQCT-OVA和OVA的紫外吸收圖譜有顯著區(qū)別，DQCT-OVA在280 nm附近的最大吸收峰明顯左移，可能是與DQCT偶聯(lián)所致，表明DQCT與載體蛋白OVA偶聯(lián)成功。

2.2 最佳包被原濃度和抗體稀釋度

倍比稀釋檢測抗原DQCT-OVA及抗血清，采用方陣滴定法確定檢測抗原的最佳包被濃度和抗血清的最佳稀釋倍數(shù)，結(jié)果見表1。

選擇OD值接近1.0且變化明顯的一列對應(yīng)的包被濃度作為最佳包被原濃度，綜合考慮，選擇5 μg·mL-1為最佳包被原濃度，最佳抗體稀釋度為1∶8000。

表1 DQCT-OVA和抗血清工作濃度的測定

2.3 多克隆抗體的效價(表2)

由表2可知，2#小鼠效價達(dá)到1∶128 000，1#、4#小鼠效價為1∶32 000，5#小鼠效價為1∶16 000。

2.4 酶標(biāo)抗原DQCT-OVA-HRP和多克隆抗體的最佳工作濃度

將抗DQCT多克隆抗體按1∶4000、1∶8000、1∶16 000、1∶32 000梯度稀釋，配制不同濃度的DQCT-OVA-HRP(25 μg·mL-1、12.5 μg·mL-1、6.25 μg·mL-1)，采用方陣滴定法測定酶標(biāo)抗原和多克隆抗體的最佳工作濃度,結(jié)果如表3 所示。

表2 小鼠抗體效價測定結(jié)果

注：包被濃度5 μg·mL-1

表3 多克隆抗體和酶標(biāo)抗原工作濃度的測定

注：N為不含DQCT的溶液，P為DQCT濃度為200 μg·mL-1的溶液

由表3可知，酶標(biāo)抗原最佳工作濃度為12.5 μg·mL-1，多克隆抗體的最佳稀釋度為1∶16 000。

2.5 直接競爭法和間接競爭法測定DQCT

分別用間接競爭ELISA法和直接競爭ELISA法測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖3所示。DQCT標(biāo)準(zhǔn)品的濃度最高設(shè)為1000 μg·mL-1，用間接競爭ELISA法檢測時小于此濃度的OD值變化不明顯，而在此濃度時OD值陡然下降，產(chǎn)生的最高抑制率只有50%左右，即IC50>1000 μg·mL-1，要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線需要繼續(xù)提高濃度，但對檢測已沒有意義。

圖4是基于抗DQCT多克隆抗體建立的直接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，IC50為39.8 μg·mL-1，以IC20～I(xiàn)C80作為檢測范圍，檢測范圍為1.6～1258.9 μg·mL-1。雖然直接競爭ELISA法靈敏度仍不夠高，但與間接競爭ELISA法相比優(yōu)勢明顯，為繼續(xù)改進(jìn)脫二氧喹烯酮的檢測方法和后續(xù)實際樣品的檢測奠定了基礎(chǔ)。

圖4 直接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

間接競爭ELISA法測定DQCT時，IC50值較高，原因可能是DQCT經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造之后與載體蛋白偶聯(lián)，使原有的特征結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，得到的抗體對小分子的原結(jié)構(gòu)識別能力較弱，導(dǎo)致靈敏度較低。而在直接競爭ELISA法中，通過對檢測抗原偶聯(lián)HRP之后，使之結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，降低了抗體對檢測抗原中DQCT的識別能力，同時提高了對DQCT原結(jié)構(gòu)的識別能力，使靈敏度提高。

2.6 多克隆抗體的特異性(表4)

由表4可知，DQCT與其原型喹烯酮、脫二氧喹烯酮羰基還原物、乙酰甲喹、脫二氧乙酰甲喹無交叉反應(yīng)，但與喹賽多及其代謝物脫二氧喹賽多有一定的交叉反應(yīng)，可能是脫二氧喹烯酮經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造之后，與喹賽多的結(jié)構(gòu)相似所致。

3 結(jié)論

目前對于脫二氧喹烯酮的人工抗原的合成、多克隆抗體的制備和免疫學(xué)檢測還未見報道。本實驗利用脫二氧喹烯酮的酮基作為活性基團(tuán)，引入連接臂，分別采用混合酸酐法和碳二亞胺法合成了免疫原和包被原，經(jīng)過鑒定，人工抗原的合成是成功的。通過免疫小鼠，獲得了效價最高達(dá)1∶128 000的多克隆抗體，效價較高，特異性實驗表明多克隆抗體只與喹賽多及其代謝物脫二氧喹賽多有較低的交叉反應(yīng)，與脫二氧喹烯酮的原型藥沒有交叉反應(yīng)，說明制備的多克隆抗體能特異性檢測脫二氧喹烯酮。對間接競爭ELISA法和直接競爭ELISA法測定脫二氧喹烯酮靈敏度進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)直接競爭法靈敏度更高，從而建立了檢測脫二氧喹烯酮的直接競爭ELISA法，其IC50為39.8 μg·mL-1，檢測范圍為1.6～1258.9 μg·mL-1。直接競爭法具有檢測時間短、無需使用酶標(biāo)二抗等優(yōu)點。為脫二氧喹烯酮單克隆抗體的制備及檢測方法的進(jìn)一步優(yōu)化和實際樣品的檢測奠定了基礎(chǔ)。

表4 抗體的特異性

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