尋常型銀屑病皮損中磷酸化信號轉導和轉錄激活因子-3與白介素-17的表達及意義

盧井發 羅迪青

中山大學附屬第一醫院黃埔院區皮膚科，廣東 廣州 510700

銀屑病是多基因遺傳背景下免疫系統異常引起的疾病，目前的研究主要集中在免疫系統和角質形成細胞方面。PStat3是信號轉導和轉錄激活因子（signal transducers and activators of transcrip tion，Stat）家族中重要成員——信號轉導和轉錄激活因子-3（Stat3）的活化形式，它通過酪激酶-Stat途徑廣泛參與細胞的存活、增殖、分化、凋亡、血管發生、轉移以及免疫調節等過程。Sano等[1]研究K5.Stat3 C銀屑病小鼠模型時，發現真皮上層和表皮層CD4+T細胞顯著增多，并提出Stat3是連接免疫細胞和活化的角質形成細胞間的橋梁。Mathur等[2]在實驗中發現Stat3缺陷小鼠的IL-17表達減少，相反，過度持續表達的Stat3能增加IL-17表達。此外，Stat3可直接與IL-17啟動子結合誘導IL-17表達。為進一步研究銀屑病的發病機制，本研究應用免疫組織化學方法檢測銀屑病皮損中P-Stat3和IL-17的表達，并分析兩者之間的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗組皮膚組織取自于2009年1月～2010年4月中山大學附屬第一醫院皮膚科及黃埔院區皮膚科就診患者。入選標準：臨床及病理均符合銀屑病診斷，2個月內未系統用藥及1個月內未外用藥物，不伴類風濕關節炎、腫瘤、肝腎功能損傷等其他嚴重疾病以及妊娠、哺乳期婦女。共23例，其中，男16例，女7例；年齡3～60歲，中位年齡31歲；病程1周～13年。并根據皮損面積及嚴重程度評分（psoriasis area and severity index，PASI）標準[3]記錄患者PASI分值。14例正常對照皮膚組織取自于我院整形外科。研究符合并通過醫院倫理委員會批準（中山一院論審[2009]110），檢查前簽訂患者知情同意書。

1.2 試劑

一抗：兔抗人單克隆抗體 Phospho-Stat3（Tyr705）購自Cell Signaling Technology公司；鼠抗人IL-17單克隆抗體購自于Satacrutz公司；即用型SP試劑盒購自于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 方法

采用免疫組化ABC法，嚴格按照說明書操作，IL-17一抗（1∶100）和 P-Stat3 一抗（1∶50），用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判斷

P-Stat3：參照文獻[4]，采用半定量計算判斷陽性表達結果：陽性細胞百分數≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～75%為2分，>75%為3分；陽性強度呈淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分，兩項相乘為強度積分。IL-17：以真皮層血管為中心，在400倍鏡下取5個視野計數陽性細胞數。分別由兩人獨立閱片，差別較大者，取協商的結果。

1.5 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。銀屑病皮損及正常對照組的P-Stat3和IL-17的比較用兩樣本比較的Mannwhitney U秩和檢驗，兩者間的關系采用Spearman相關分析，兩者與PASI評分間的關系采用Spearman等級相關性分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

銀屑病皮損的PASI評分為2.0～45.3分，中位數為8.4分。

皮膚中P-Stat3、IL-17的表達：尋常型銀屑病皮損與正常對照皮膚組織中均有P-Stat3表達（圖1、2），尋常型銀屑病皮損P-Stat3陽性表達主要位于表皮棘細胞層的胞核中，少數位于顆粒層和基底細胞層（圖1），正常對照組主要位于基底細胞層的細胞核中（圖2），銀屑病皮損IL-17陽性表達主要位于真皮淺層淋巴細胞胞漿中（圖3），而正常對照組皮膚組織中無IL-17的表達（圖4）。

與對照組相比，實驗組皮損中P-Stat3、IL-17水平升高，差異有高度統計學意義（Z=-5.043、-4.324，均 P<0.01）。實驗組皮損中P-Stat3、IL-17水平與PASI呈正相關，差異有高度統計學意義（rs=0.713、0.797，均P<0.001）。而皮損中PStat3與IL-17呈正相關，差異有高度統計學意義（rs=0.762，P<0.001）。 見表 1。

表1 尋常型銀屑病皮損與正常對照皮膚中磷酸化信號轉導和轉錄激活因子-3與白介素-17的比較

3 討論

3.1 尋常型銀屑病皮損中P-Stat3的表達

P-Stat3是Stat3的活化形式，可以識別并結合靶基因DNA特異的反應元件，誘導抗凋亡基因如Bcl-xl、Bcl-2、Mcl-1和細胞周期調控基因如c-Myc、cyclinD1及內血管內皮生長因子（VEGF）等的表達[5-6]，與中樞神經系統疾病、腫瘤、自身免疫性疾病等多種疾病相關。國內研究證實銀屑病皮損中P-Stat3增多，陽性表達主要位于棘細胞層和顆粒層細胞的胞核中[7-9]，本實驗發現尋常型銀屑病皮損中P-Stat3表達增多且與PASI評分呈正相關，實驗結果與文獻相符合，進一步證實P-Stat3與銀屑病的發病機制相關。此外，筆者發現實驗組P-Stat3陽性表達主要位于棘細胞層的胞核中，少數位于顆粒層和基底細胞層，對照組P-Stat3陽性表達主要位于基底細胞層的胞核中，實驗組P-Stat3表達部位較正常對照上移，其具體原因尚不清楚；是否與銀屑病皮損中表皮細胞增生周期縮短、細胞由基底細胞層較快移行到棘細胞及顆粒細胞有關，有待進一步研究。

3.2 尋常型銀屑病皮損中IL-17的表達

IL-17主要由Th17細胞分泌，是Th17細胞的標志細胞因子，主要生物學作用是促炎癥反應，可正調節一些細胞因子和基質金屬蛋白酶，引起中性粒細胞向炎癥區域募集[10]。IL-17與風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、哮喘等免疫介導的疾病相關，國內外研究證實銀屑病患者血液及皮損中IL-17水平增多，并與銀屑病嚴重程度呈正相關[11-13]。銀屑病皮損中IL-17A mRNA水平升高，且與皮損內IL-23R mRNA水平以及PASI評分呈線性正相關[14]。本實驗研究發現銀屑病皮損真皮層IL-17表達增加，陽性表達主要位于真皮淺層，且IL-17水平與銀屑病嚴重程度的PASI評分呈正相關，進一步證實IL-17在銀屑病的發病機制中起主要作用。

圖1 尋常型銀屑病皮損處磷酸化信號轉導和轉錄激活因子-3表達

圖2 正常對照皮膚中磷酸化信號轉導和轉錄激活因子-3表達

圖3 尋常型銀屑病皮損處白介素-17表達

圖4 正常對照皮膚中白介素-17表達

3.3 尋常型銀屑病皮損中P-Stat3與IL-17的關系

RORγt和RORα是原始T細胞向Th17細胞早期轉化過程中的關鍵性細胞因子。在銀屑病皮損中，Th17細胞主要分泌IL-6、IL-17、IL-23等細胞因子。有研究發現IL-6、IL-21和IL-23等可誘導Stat3磷酸化形成P-Stat3，P-Stat3可與IL-17mRNA的啟動子結合，促進IL-17mRNA基因轉錄，上調RORγt和RORα的表達，進而上調IL-17的水平[10,15]。研究還發現Stat3的缺乏可使原始T細胞不能表達RORγt，從而減少原始T細胞向Th17細胞分化[16]。此外，P-Stat3可促進IL-23R的表達，IL-23作用于IL-23R，誘導RORγt表達，形成成熟Th17細胞[17-20]。本實驗發現尋常型銀屑病皮損中P-Stat3和IL-17表達呈正相關，且與銀屑病嚴重程度呈正相關，提示P-Stat3和IL-17在銀屑病發病機制中起重要作用，但PStat3與IL-17的具體作用機制還有待進一步研究。

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