Ezrin蛋白在宮頸脫落細胞中的表達研究及其與HPV16/18感染的相關性

張 帆 楊可達

1.中南大學湘雅醫院婦產科，湖南長沙 410008；2.中南大學湘雅醫院皮膚科，湖南長沙 410008

宮頸癌是婦科臨床上較為常見的惡性腫瘤之一，近年來臨床發病率呈現上升及年輕化的趨勢，由于該病患者病死率較高，嚴重威脅了廣大女性的健康[1]。最新研究表明，埃茲蛋白（Ezrin）)是惡性腫瘤的發展、浸潤和轉移過程中的關鍵調節因子，其主要是通過調節黏附分子及信號傳導等途徑實現的[2]。本研究對Ezrin蛋白的表達與宮頸癌關系及其與人乳頭瘤病毒（HPV）感染的相關性作進一步探討，旨在為Ezrin蛋白的臨床輔助作用奠定分子生物學基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2009年10月—2011年12月期間，我院婦科進行手術治療的宮頸癌患者113例，年齡42～65歲之間，平均年齡（54.62±12.81）歲。依據宮頸細胞病理學診斷報告（TBS）分類系統，其中19例為不能明確意義的不典型鱗狀上皮細胞（ASC－US）；14例為低度鱗狀上皮內病變（LSIL），均經病理切片診斷為CINⅠ；49例為高度鱗狀上皮內病變（HSIL），經病理切片診斷為CINⅡ～Ⅲ；以及31宮頸鱗狀細胞癌（CSCC）患者，經病理切片確診為鱗狀細胞癌。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本的處理 采用宮頸刷收集患者的宮頸脫落細胞樣本，用4%甲醛溶液固定48h后，常規石蠟包埋，連續切片，對Ezrin蛋白進行免疫組化SP法檢測。剩余細胞進行消化處理：50 mmol/L Tris，pH8.0；1 mol/L EDTA，pH8.0；0.5% 吐 溫－20，0.2μg/μL 蛋 白酶 K，ddH2O；55℃水浴 2～3 h后離心，濃縮至 20 μL后可作為DNA模板進行HPV16/18的檢測。

1.2.2 免疫組織化學檢測Ezrin蛋白 采用免疫組化SP法檢測Ezrin蛋白的表達情況，具體步驟嚴格按照說明書進行。陽性對照采用已知陽性片，陰性對照采用PBS代替第一抗體。陽性結果判定標準[3]：分別采用低倍和高倍鏡觀察全片，Ezrin陽性染色為細胞膜或細胞漿內出現棕黃色顆粒。在相同放大倍數(×400)下隨機選取切片的5個視野，并隨機計數100個細胞，當陽性細胞數＜5%時為陰性(－)，當陽性細胞數≥5%為陽性(＋)。

1.2.3 多重引物PCR技術檢測HPV16/18 HPV16的特異性引物選擇E6、E7基因區，擴增長度395 bp；HPV18的特異性引物選擇L1基因區，擴增長度116 bp。PCR擴增條件為：94℃預變性8～10 min，94 ℃變性 30 s，53～55℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，32 個循環。PCR產物采用2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統下觀察，395bp及116bp為陽性條帶。

1.3 統計方法

采用SPSS 12.0軟件進行統計分析，陽性率對比分析采用χ2檢驗，采用Spearman相關性分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Ezrin蛋白及HPV16/18在宮頸脫落細胞中的表達

與 ASC－US患者相比，LSIL、HSIL以及 CSCC患者 Ezrin蛋白及HPV16/18 DNA表達的陽性率明顯提高，差異均具有統計學意義（P＜0.05），結果見表 1。

表1 Ezrin蛋白及HPV16/18在宮頸脫落細胞中的表達

2.2 Ezrin蛋白與HPV16/18DNA表達的相關性

Ezrin蛋白與HPV16/18 DNA表達，經Spearman等級相關性分析，二者呈現正相關（rs＝0.768,P＜0.05）。

3 討論

宮頸癌是由HPV病毒直接通過皮膚接觸而傳播的惡性腫瘤，已有研究證明，在宮頸癌的發病初期患者幾乎是沒有任何臨床癥狀的，當病情發展到一定階段后才會出現異常陰道流血現象[4]。同時HPV病毒感染與宮頸上皮瘤樣變的發生密切相關，但其并不是細惡性轉化的唯一因素，需要其他致病因素的共同存在。埃茲蛋白(Ezrin)作為膜細胞骨架連接蛋白，屬于ERM(Ezrin、Radixin、Moesin)成員之一，其能夠參與細胞與細胞、細胞與基質之間的作用，在腫瘤發展、浸潤和轉移過程中發揮了重要作用[5]。

本研究結果表明，與ASC－US患者相比，LSIL、HSIL以及CSCC患者Ezrin蛋白及HPV16/18 DNA表達的陽性率明顯提高，差異均具有統計學意義（P＜0.05），且二者呈正相關。由此可見，Ezrin蛋白早期宮頸癌的篩查具有重要意義，有一定的臨床應用價值。

[1]曹翠明,周亞濱,張麗.實時熒光定量PCR反應檢測宮頸脫落細胞人乳頭瘤病毒16/18型和巨細胞病毒的協同作用[J].醫學檢驗與臨床,2006,17(5):7－8.

[2]Khanna C,Wan XL,Bose S,et al.The membrane－cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis[J].Nat Med,2004,10(2):182－186.

[3]王秋蘭.宮頸癌中Ezrin和Survivin的表達及其與浸潤和轉移的關系[J].中國婦幼保健,2010,25(10):1405－1407.

[4]申鵬,蘇寧,陳斌,等.埃茲蛋白表達與肝細胞癌增值及轉移的關系研究[J].解放軍醫學雜志,2009,34(6):737－739.

[5]徐飛,吳強,孫志華,等.宮頸癌中Ezrin和CD44－V6的表達及其相關性[J].江蘇醫藥,2010,36(21):2494－2496.