浙貝母遺傳多樣性的ISSR分析

周 潔，王忠華

(1.浙江理工大學 生命科學學院，浙江 杭州 310018;2.浙江萬里學院生物技術研究所，浙江 寧波 315100)

貝母(Fritillaria L.)屬于百合科(Liliaceae)多年生草本植物。中藥貝母為干燥鱗莖，《中華人民共和國藥典》(2005版)將其分為土貝母、川貝母、平貝母、伊貝母、浙貝母和湖北貝母6大類［1］。浙貝母根據分類學的不同又分為大貝、中貝、小貝，或者分為為狹葉貝母、寬葉貝母、多籽貝母。浙貝母是浙江重要道地中藥材“浙八味”之一，具有極高的藥用價值。中醫認為其苦、寒，歸肺、心經，具有清熱散結、化痰止咳功能。至20世紀90年代，經過對其藥理作用的深入研究，認為浙貝母具有鎮咳、祛痰、松弛氣管平滑肌、鎮痛抗炎、活血化瘀、溶石、抗潰瘍、止瀉、抗菌、抗腫瘤等作用［2］。浙貝母原產于浙江寧波象山，而目前，其栽培基地主要分布于鄞州、磐安、縉云等地區，年栽培面積達3.97萬hm2。現在，磐安地區已成為浙貝母主要產地，同時也是浙貝母良種選育與種苗輸出的重要基地，面積在300 hm2以上［3］。但實際調查發現，磐安地區的浙貝母存在種質資源混雜的現象，這對浙貝母的育種產生不良的影響。本文針對磐安地區的浙貝母進行品種及種內遺傳多樣性研究，為新品種選育奠定基礎。

簡單序列重復區間ISSR(inter-simple sequence repeat)是一種基于微衛星系列的分子標記技術，它結合了隨機引物擴增多態DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)和簡單重復序列(simple sequence repeat，SSR)標記技術的優點，與以往的分子標記相比，能夠提供更多的基因組DNA信息。此方法現已廣泛應用于藥用植物種質資源鑒定、進化與親緣關系分析、遺傳多樣性與居群遺傳結構檢測、遺傳作圖、基因定位、分子標記輔助育種等方面研究［3］。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

本文的浙貝母材料采自浙江磐安新渥、浙江磐安雙峰、浙江磐安宅口村等種植基地。材料的來源及品種名稱分別為磐安狹葉貝母、南通小貝、磐安雙峰狹葉貝母、磐安新渥大貝、磐安新渥多籽貝、磐安宅口狹葉貝母、磐安新渥中貝、磐安新渥多籽貝、磐安新渥中貝、磐安新渥中貝、磐安新渥本地大貝和磐安新渥本地大貝，編號分別為1—10。

1.2 浙貝母基因組DNA提取

采用改良CTAB法進行浙貝母基因組DNA的提取，具體操作如下:取新鮮葉片0.1 g，用液氮研磨成粉末，放入1.5 mL的 EP管中，加入800 μL預熱的CTAB提取緩沖液，混勻后65℃水浴1 h，13 000 r·min－1離心 15 min，取上清液，加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)輕輕混勻，13 000 r·min－1離心15 min，重復此步驟1次;取上清，加入2/3體積的異丙醇，放入－20℃冰箱30 min 沉淀 DNA;13 000 r·min－1離心10 min，倒掉上清液，再加入200 μL 70%乙醇洗滌DNA 2～3次;將1.5 mL Ep管倒置于通風柜里，使 DNA盡量干燥;加入 500 μL的 TE，溶解 DNA;置于4℃冰箱保存，備用。DNA質量用0.8%瓊脂糖電泳檢測，DNA純度和濃度通過紫外吸收法測定。

1.3 ISSR-PCR擴增

經過比較和優化，ISSR-PCR的反應體系為:10 × PCR Buffer 2 μL，25 mmol MgCl22 μL，10 μmol 引 物 1 μL，dNTP 1.6 μL，ddH2O 12.5 μL，Tag 酶 0.4 μL 和模板 DNA 0.5 μL。

擴增反應:94℃ 預變性5 min;94℃變性45 s，50 ～ 60℃ 退火 45 s，72℃ 延伸 90 s，35個循環;72℃ 延伸10 min;4℃ 保存。

ISSR引物采用加拿大哥倫比亞大學(UBC)公布的序列(http://www.biotech.ubc.ca/serices/naps/primers/primers.pdf)，由上海生工合成。從30個引物中篩選出7個擴增條帶較多、信號強、背景清晰的引物用于ISSR分析。

1.4 擴增產物檢測

PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，以2 000 bp marker作為標準分子量對照，在120 V穩定電壓條件下電泳1.5 h左右，再用EB染色15～20 min后，用凝膠成像儀拍照。

1.5 數據分析

在瓊脂糖凝脂電泳圖譜上，電泳條帶按有或無記錄，電泳條帶清晰的賦值為1，否則賦值為0。用NTSYS-PC(version 2.10)軟件系統計算材料間遺傳相似系數(GS)。并通過非加權配對算術平均法(UPGMA)進行聚類分析，建立親緣關系圖［4］。

2 結果與分析

2.1 擴增產物的多態性分析

采用30個ISSR引物對隨機選擇的2份貝母材料進行PCR擴增，從中篩選出7個穩定性強、重復性好、多態性豐富的引物對所有貝母材料進行擴增。擴增結果見表1。

表1 ISSR引物序列及擴增產物多態性

從ISSR擴增條帶統計結果來看，7個引物共得到483條擴增帶，其相對分子質量在200～2 000 bp，其中多態性帶315條，多態性條帶百分率為65.22%，不同引物擴增出的清晰條帶數在5～10，平均每個引物擴增出的片段條數為7.9條，擴增的多態性條帶數范圍為3～9，每個引物的多態性百分率為50% ～100%，平均每個ISSR引物擴增出的多態性條帶的數目為6，其中引物815，895的擴增結果如圖1所示。

圖1 引物UBC815、UBC895 ISSR-PCR擴增結果

2.2 遺傳相似系數分析

本試驗收集了不同產地、品種的浙貝母，分析這些不同產地、不同品種間的遺傳多樣性，遺傳相似系數統計結果如表2所示。

表2 浙貝母遺傳相似系數分析結果

表2結果發現，所有貝母材料間的GS平均值為0.639 9，變化范圍為0.433 3～0.933 3，其中南通小貝和磐安雙峰狹葉貝母的GS(0.933 3)值最大，這表明其遺傳相似性最高，遺傳分化很小。而南通小貝和磐安新渥大貝、磐安新渥本地種大貝間的GS(0.433 3)最小，同時磐安新渥本地大貝和磐安雙峰狹葉貝母、南通小貝、磐安新渥多籽貝間的GS(0.433 3)也是最小。由此表明，南通小貝和磐安新渥大貝之間，磐安新渥本地種大貝與南通小貝、磐安雙峰狹葉貝母、磐安新渥多籽貝之間的遺傳相似性最小，發生了較大的遺傳分化。

2.3 親緣關系聚類分析

根據ISSR標記計算的遺傳相似系數矩陣，采用NTSYS 2.10軟件按UPGMA法構建8份材料的親緣關系聚類分析結果(圖2)。

圖2 浙貝母親緣關系聚類結果

從圖2可看出，8份浙貝母種質可以分為兩大類群:第1大類群包括磐安狹葉貝母、磐安新渥大貝和磐安本地種大貝，其中磐安新渥大貝和磐安新渥本地大貝聚為1類，這說明磐安大貝的遺傳分化程度較小;第2大類群則包括南通小貝、磐安雙峰狹葉貝母、磐安新渥多籽貝、磐安宅口狹葉貝母和磐安新渥中貝。

3 小結和討論

試驗表明，經過挑選后的ISSR引物擴增后，DNA多態性好，條帶清晰，且聚類結果可以將所有材料區分開。由此可見，ISSR標記技術適合用于浙貝母種質資源的鑒定與遺傳多樣性研究。從實驗結果來看，不同浙貝母材料的遺傳多樣性平均值為0.639 9，變化范圍在0.433 3～0.933 3。這表明磐安的浙貝母種質資源間存在較豐富的遺傳多樣性。根據實地調查發現，浙江磐安栽培的浙貝母都是群體內將選留的鱗莖進行種植，即營養繁殖，這是導致栽培的浙貝母種群間遺傳分化的最大的原因。不同產地，相同的品種如狹葉貝母經過不同地方的種植，遺傳相似性較小，如磐安狹葉貝母與磐安雙峰狹葉貝母GS僅為0.500 0，與磐安宅口村的狹葉貝母GS為0.616 7，這也許與長期隔離發生的遺傳分化有關。磐安產浙貝母資源不僅在種間存在著遺傳差異，種內也存在著遺傳多樣性。如磐安新渥多籽貝種內GS為0.816 7，磐安新渥中貝種內GS為0.783 3，而磐安新渥本地種大貝種內的遺傳差異最大，GS值為0.500 0，這可能由于種質資源混雜造成的。因此，利用遺傳因素來區分種質，尋找合適的育種資源，以減輕種質資源混雜現象是必要的。另外，在浙貝母的生產過程中，控制不同品種栽培群體的傳播，也是避免混雜的一種途徑。

隨著科學技術的發展，對中藥材種質資源的鑒定從最初的形態學鑒定到細胞學標記技術即核型分析和解剖學鑒定;然后是生化大分子標記包括同功酶和蛋白質指紋標記;也有通過化學成分進行種質鑒定和分類［5］。但這些方法由于本身的限制不能直接地反映種質的遺傳特性。近來發展起來的分子標記技術使得分子水平的鑒定成為可能，并得到了廣泛的應用。2006年，李玉鋒等［6］采用 RAPD這種分子標記技術對8種貝母種進行鑒定。2009年，陸含等［7］也采用 RAPD對浙貝母進行鑒定。但由于RAPD的重現性較差，對種間和近緣屬間親緣關系研究有較大的局限性。目前，主要是運用ISSR標記法對浙貝母進行鑒定。如2010年，劉曉賢等采用ISSR-PCR技術對浙貝母種質進行遺傳分析。另外，也有采用AFLP對浙貝母進行種質的遺傳多樣性分析，如2010年徐金中等［8］對浙江主產區栽培的浙貝母進行的遺傳多樣性分析。現在，更為準確的分子鑒定技術也漸漸發展起來，如對核糖體ITS序列，葉綠體基因組rbcL，trnL2F，matK序列的研究等。因此，針對浙貝母的種質資源的鑒定、親緣關系研究等問題，在未來幾年內可采用這些新興的分子標記技術進行研究與育種應用。

［1］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(第一卷)［M］．北京:化學工業出版社，2005:205．

［2］張明發，沈雅琴．浙貝母藥理研究進展［J］．上海醫藥，2007，10(28):459－461．

［3］王明明，宋振巧，王建華．ISSR標記技術及其在藥用植物遺傳育種中的應用［J］．中草藥，2007，38(1):134－137．

［4］黎開強，吳衛，鄭有良，等．川產貝母種質資源遺傳多樣性的ISSR分析［J］．中國中藥雜志，2009，34(17):2149－2154．

［5］程遠輝，張興翠．分子標記技術在中藥鑒定中的應用［J］．現代中藥研究與實踐，2006，20(2):58－60．

［6］李玉鋒，唐琳，陳放．8種貝母的 RAPD分析［J］．中成藥，2006，28(10):1528－1529．

［7］陸含，朱世華，周書軍，等．浙貝母4品種及5種貝母遺傳多樣性的 RAPD分析［J］．寧波大學學報:理工版，2009，22(1):44－47．

［8］徐金中，張紅葉，馬喜彥，等．浙江主產區栽培浙貝母種質遺傳多樣性的 AFLP分析［J］．中草藥，2010，41(1):109－113．