環境條件對轉基因高粱Cry1Ab蛋白含量的影響

盧美貞，崔海瑞

(1.浙江工業大學 化學工程與材料學院，浙江杭州 310014;2.浙江大學原子核農業科學研究所，浙江杭州 310029)

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)在芽孢形成時可產生具有殺蟲活性的晶體蛋白［1］，被稱為殺蟲晶體蛋白或 δ-內毒素［2］。Schnepf等［3］首次成功地克隆了第1個編碼Bt殺蟲晶體蛋白基因，揭開了利用基因工程培育抗蟲轉基因植物的序幕。目前它已成為植物抗蟲基因工程中應用最廣泛的抗蟲基因。

浙江大學原子核農業科學研究所首次成功地將來自Bt密碼子優化的以玉米泛素為啟動子的Cry1Ab抗蟲基因轉入高粱中［4］，并經農業部批準進入中間試驗階段。轉基因高粱的獲得為這一作物的品種改良提供了抗蟲資源。為有效和合理地利用這一資源，有必要了解不同光照時間、不同溫度和不同水平氮肥處理下，Cry1Ab基因在高粱中的表達情況。本研究以轉Cry1Ab基因高粱SR16-2和SR24-2為材料，研究不同光照時間、不同溫度和不同水平氮肥處理下，Cry1Ab基因在高粱中的表達特性。

1 材料與方法

1.1 材料

研究所用的材料為高粱原受體親本115R及其轉入Cry1Ab基因的2個穩定轉化株系，這2個株系處于 R5代，編號分別為 SR16-2和 SR24-2，它們分別來自2個獨立轉化株，系采用農桿菌介導法培育而成［4］。

1.2 處理設計

1.2.1 光照處理

取SR16-2和SR24-2株系干種子各100粒，進行常規浸種、催芽，種子萌動后放在人工培養室28℃恒溫下培養，設3次重復，每重復20粒種子，設置的光照時間分別為 10，12，14，16和18 h，待幼苗長到3葉期時，各處理隨機取幼苗(去根)5個測Cry1Ab蛋白含量。

1.2.2 溫度處理

取SR16-2和SR24-2株系干種子各100粒，進行常規浸種、催芽，種子萌動后放在光照培養箱中培養，每日相同光強光照12 h，設計了5個溫度水平，分別為20，25，30，35和40℃，濕度在75%左右，設3次重復，每重復20粒種子，待幼苗長到3葉期時，各處理隨機取幼苗(去根)5個，測Cry1Ab蛋白含量。

1.2.3 施氮水平處理

取SR16-2和SR24-2株系干種子各100粒，進行常規浸種、催芽，萌動后將種子播種于網室，分別設置 4個基肥純氮水平，0，300，450和600 kg·hm－2，進行常規栽培，在拔節期各處理分別隨機選5株取葉片測Cry1Ab蛋白含量。

1.3 Cry1Ab蛋白測定

以上所取樣品洗凈后稱重，在液氮中磨成粉狀，放入離心管中，按4 μL·mg－1的比例加適量蛋白提取緩沖液(試劑盒隨帶)，充分混勻后置于4℃浸提3 h，5 000 r·min－1離心 5 min，上清液或其稀釋液即可用于測定。將100 μL樣品提取液加入到已包埋好抗體的96孔板中，同時加入不同濃度(0，0.5，2.5，5.0 ng·mL－1)的 Cry1Ab蛋白標準溶液，按 Cry1Ab/Cry1Ac板式試劑盒(美國ENVIROLOGIX公司)提供的方法進行測定，最后根據酶標儀(SpactronMax190，德國)在波長為450 nm下D的讀數，參照標準曲線和提取液稀釋倍數計算出各器官組織Cry1Ab殺蟲蛋白含量，以樣品中所含的Cry1Ab蛋白含量來表示(ng·g－1)，測定時各設3次重復。

2 結果與分析

2.1 不同光照時間對Cry1Ab蛋白量的影響

對不同光照長度處理的Cry1Ab蛋白含量測定結果如圖1。

圖1 不同光照時間下轉基因高粱幼苗中Cry1Ab蛋白含量

由圖1可見，在10，12，14，16和18 h等不同光照時間處理后，2個轉基因株系的Cry1Ab蛋白含量平均分別為 1.05，2.10，1.40，1.94和1.67 ng·g－1，以光照12 h時的 Cry1Ab蛋白含量最高，光照10 h的表達量最低，二者相差1倍以上，表現趨勢為12 h＞16 h＞18 h＞14 h＞10 h，且2個轉基因株系表現出相同的趨勢。說明光照長度對Cry1Ab蛋白表達量具有一定的影響。

2.2 不同溫度處理對Cry1Ab蛋白量的影響

對Cry1Ab蛋白含量測定結果顯示，不同溫度處理對 Cry1Ab蛋白含量也有較大影響(圖2)。25℃培養時葉片中 Cry1Ab蛋白含量最高，達到2.24 ng·g－1，溫度升高，Cry1Ab蛋白含量呈現下降趨勢，40℃最低，只有0.44 ng·g－1，20℃時葉片中Cry1Ab蛋白含量比35℃略高。可見溫度也是影響Cry1Ab蛋白表達水平的一個重要環境因素。

圖2 不同溫度處理下轉基因高粱幼苗中Cry1Ab蛋白含量

2.3 不同施肥水平對Cry1Ab蛋白量的影響

圖3是對不同施氮水平下Cry1Ab蛋白量的測定結果。當以 300，450，600 kg·hm－2不同施氮水平作基肥處理時，SR16-2轉基因高粱株系葉片中的Cry1Ab蛋白含量比未施基肥的對照分別顯著提高85.40%、48.66%和12.90%;在另一轉基因高粱株系SR24-2中，施肥后的Cry1Ab蛋白含量與對照相比差異更大，分別提高了200.42%，50.42%和39.58%。結果表明，施肥可以促進Cry1Ab蛋白的合成，作基肥的以300 kg·hm－2純氮效果最佳。

圖3 不同施N基肥量下轉基因高粱Cry1Ab蛋白含量

3 小結與討論

Bt蛋白含量的高低直接影響著轉 Bt基因植物的抗蟲效果，而環境因素對Bt基因的表達起著重要的調節作用［5］，尤其是當 Bt基因處于誘導型啟動子控制下時，這種影響更為突出。因此，闡明環境因素對Bt基因表達水平的影響對轉Bt基因植物的合理栽培與利用具有重要的指導作用。本研究的結果表明，光照、溫度和氮肥對Cry1Ab蛋白表達量都具有明顯的影響，為轉Cry1Ab基因高粱的進一步應用提供了理論依據。

溫度對外源基因的表達起著重要的調節作用［6］。Takimot等［7］曾報道玉米泛素啟動子的表達不受系統調節，而是受獨立的對熱擊或物理脅迫產生反應的細胞調節，在受脅迫情況下，該啟動子會改變它的表達特性。此外，Meyer［8］也曾報道過溫度會影響轉基因矮牽牛中35S啟動子的甲基化。本研究所用轉基因高粱中的Cry1Ab基因是由玉米泛素啟動子驅動的，研究結果顯示，溫度對轉基因高粱Cry1Ab蛋白含量有較大的影響，高溫不利于Cry1Ab蛋白的表達，這與吳剛［9］對玉米泛素啟動子控制的Cryab在轉基因水稻中表達量受溫度調節的研究結果相一致，都證明了 Takimoto等［7］的結論，也與夏蘭芹等［10］報道棉花中35S啟動子引導的Bt基因所表達的殺蟲蛋白量在高溫脅迫后急劇下降的結果相似。此外，在轉Bt基因棉花中也有因氣溫反常導致抗蟲性下降的報道［11］。因此，在轉Bt基因抗蟲植物的種植過程中，應根據溫度預報情況加強監測，在高溫期到來之際綜合采用其他防治措施。

合理施肥是作物栽培管理的關鍵。施肥直接促進根系對氮素等養分的吸收，進而影響植株體內蛋白質的合成。在轉Bt基因棉花中，王家寶等［12］報道追肥可提高葉片中的Bt蛋白含量，且隨追肥量的增加而增加;周冬生等［13］也報道隨追肥量的增加轉Bt基因棉抗蟲性增強。本研究結果表明，施氮基肥有助于Cry1Ab蛋白含量的提高，但是隨著施氮量的增加Cry1Ab蛋白含量并未呈現增長的趨勢，反而有所下降。由此可見，作基肥與追肥的效果不同。因此，對轉Bt基因抗蟲植物的施肥，不但要控制氮肥的量，還應講究施肥方式。

光照直接影響著植物的生長、發育。有關光照對轉基因表達的影響，在轉玉米A1基因的矮牽牛中已有報道［7］，但光照是否影響 Bt基因在轉基因植物中的表達水平尚未見報道。高粱屬短日照植物，臨界光周期約為12 h。本研究中發現光照12 h時轉基因高粱葉片中的Cry1Ab蛋白量最高，光照長于或短于這一時間均導致Cry1Ab蛋白含量的降低。因此，要獲得較好的抗蟲效果，在種植轉Bt基因高粱時應從光照長度這一角度考慮其合適的地域。

［1］Hannay C L．Crystalline inclusions in aerobic spore-forming bacteria［J］．Nature，1953，172:1004．

［2］Hannay C L．The protein crystals of Berliner［J］．Can J Microbiol，1955，1:694 －710．

［3］Schnepf H E，Whiteley H R．Cloning and expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein gene in Escherichia coli［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1981，78:2893－2897．

［4］張明洲．農桿菌介導高梁轉化體系的建立與 Bt(Bacillus thuringiensis)抗蟲基因的導入［D］．杭州:浙江大學，2002．

［5］Sachs E S，Benedict J H．Pyramiding Cry1A(b)insecticidal protein and terpenoids in cotton to resist tobacco budworm［J］．Environmental Entomology，1998，25(6):1257－1266．

［6］周桂生，周福才，謝義明，等．溫度脅迫對轉 Bt基因抗蟲棉毒蛋白的表達和棉鈴蟲死亡率的影響［J］．棉花學報，2009，21(4):302－306．

［7］Takimoto I，Christensen A H，Quail P H，et al．Non-system expression of a stress-responsive maize polyubiquitin gene(Ubi-1)in transgenic rice plants［J］．Plant Molecular Biology，1994，26:1007－1012．

［8］Meyer P．Endogenous and environmental factors influence 35S promoter methylation of a maize Al gene construct in transgenic petunia and in color phenotype［J］．Molecular and General Genetic，1994，6:1410－1414．

［9］吳剛．cry1Ab基因在轉基因水稻中的遺傳、表達與沉默［D］．杭州:浙江大學，2000．

［10］夏蘭芹，郭三堆．高溫對轉基因抗蟲棉中 Bt殺蟲基因表達的影響［J］．中國農業科學，2004，37(11):1733－1737．

［11］Kaiser J．Pests over whelm Bt cotton crop［J］．Science，1996，223:423－427．

［12］王家寶，王留明，沈法富，等．環境因素對轉 Bt基因棉Bt殺蟲蛋白表達量的影響［J］．山東農業科學，2000，(6):4－6．

［13］周冬生，吳振廷，王學林等．施肥量和環境溫度對轉 Bt基因棉抗蟲性的影響［J］．安徽農業大學學報，2000，27(4):352－357．