羅格列酮對阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征小型豬脂肪組織IL-6表達的影響

湯鳳蓮，周 燕，解培順 ，于冉冉，于會娜

(1桂林醫學院附屬醫院，廣西 541001;2梁山縣人民醫院)

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSAHS)發病率高、具有潛在危險。肥胖和高胰島素血癥是OSAS主要發病因素之一。羅格列酮是噻唑烷二酮類藥物，是有效的核轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)的激動劑。作為一種新型的胰島素增敏劑，具有拮抗胰島素抵抗、降低高血糖、改善脂代謝紊亂、抗動脈粥樣硬化的作用。補充研究時間?，我們觀察了羅格列酮對脂肪組織IL-6表達及高胰島素血癥、胰島素抵抗的影響，探討其治療OSAHS的可行性及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 雌性清潔級中國小型豬18只(購自廣西大學動物實驗中心)，體質量是(25±2.2)kg;醫用冰袋(北京中衫金橋生物技術有限公司生產);Trizol RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒(大連寶生物公司);TAq酶(北京天根生物公司);IL-6 mRNA引物(上海英駿生物公司);兔抗豬IL-6一抗(博士德公司)。多導睡眠監測儀1臺(美國泰科公司生產);Legendmiro 17R型微量臺式高速冷凍離心機(Thermo公司);Biometra型PCR擴增儀(德國耶拿分析儀器股份公司);JS-780型全自動凝膠成析系統(上海培清科技);酶標儀(Labsystem MK3，芬蘭);EPS 301型SDS-PAGE電泳儀(Amersham Pharmacia Biotech公司);SD轉膜儀(BIO-RAD)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備及干預 雌性清潔級中國小型豬18只，隨機分為空白對照組、模型組、羅格列酮組各6只。參照徐斌［1］等方法制作OSAHS模型，手術當天禁食、禁水，采用苯巴比妥鈉30 mg/kg耳緣靜脈注射麻醉，連接多導睡眠儀，采用金屬注射器抽取醫用冰袋內凝膠狀物8 mL和80萬U青霉素溶液防止局部感染，于動物雙側咽腭部及舌根部多點進針，緩慢注射，直至動物出現鼾聲、多導睡眠監測儀上觀察到典型的呼吸暫停圖形時即停止注射，以平均呼吸暫停次數(AI)≥30次或睡眠呼吸暫停低通氣指數(AHI)≥5次/h為造模成功指標;對照組咽腭部及舌根部注射等量生理鹽水。制模成功后治療組喂服羅格列酮4 mg/(kg·d)，對照組與模型組喂服等量生理鹽水。每組動物均在術前、術后即刻、術后2周及處死前行多導睡眠儀監測動物的睡眠呼吸暫停低通氣指數(AHI)、最低血氧飽和度(SaO2)。干預12周后處死各組動物并取大網膜脂肪組織，分別用DEPC水與無菌冰生理鹽水沖洗并剪成0.5 g大小的脂肪塊，分裝在無菌EP管中密封，迅速液氮冷凍，－80℃保存，DEPC水沖洗過的留做RT-PCR，生理鹽水沖洗過的留做蛋白質免疫印跡分析(Western blot方法)。

1.2.2 觀察項目

1.2.2.1 睡眠生理指標 采用多導睡眠監測儀監測各組平均呼吸暫停次數(AI)、睡眠呼吸暫停低通氣指數(AHI)及最低血氧飽和度(SaO2);

1.2.2.2 血清相關指標 各組麻醉后抽取耳緣靜脈血5 mL，5 000 r/min離心10 min分離血清，空腹血糖采用葡萄糖氧化酶法，胰島素、胰島素原采用放射免疫(RIA)法，采用HOMA模型公式計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)，HOMA-IR=(胰島素 ×血糖)/22.5。

1.2.2.3 肪脂組織IL-6mRNA表達 采用RT-PCR法:將超低溫凍結的大網膜脂肪組織迅速轉移至用液氮預冷的研缽中，用研棒研磨，期間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀，取研磨成粉末狀的樣品100 mg加入到含有1 mL RNAiso plus的2 mL EP管中，輕搖混勻，置于冰浴上勻漿5 min，12 000轉4℃離心5 min;加入200 μL氯仿，震蕩混勻，冰浴上靜置5分鐘，4℃、12 000 r/min離心15 min;將上清液移至新的1.5 mL EP管中，加入與上清液等體積的異丙醇，冰浴上靜置10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min;棄上清保留沉淀，加入1 mL 75%乙醇，4℃、12 000 r/min離心5 min;棄上清保留沉淀，干燥;溶解于30～50 μL DEPC處理水中。用紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度。總RNA逆轉錄成cDNA各取1 μg RNA按試劑盒操作說明逆轉錄為cDNA。取1 μL cDNA為模板，分別以IL-6的引物(上游引物5'-TCCAGACCCTGAGGCAAAAGGGA-3';下游引物5'-TGCCCGTGGACGGCATCAAT-3';擴增片段約220 bp)與內參照 β-action的引物(上游引物5'-GCTAGTCTCCAAGCGACGAA-3';下游引物5'-TACAGTCTAAAACTTTTGCCCTT-3'，擴增片段約319 bp)進行PCR擴增。取擴增產物5 μL在含有0.5 μg/mL溴已啶的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，產物條帶用凝膠成像系統照相并進行灰度分析。目的片段的相對表達量=目的基因的灰度值/β-action的灰度值。

1.2.2.4 脂肪組織IL-6蛋白表達 采用蛋白質免疫印跡法。提取各組脂肪組織總蛋白，用BSA試劑盒測定總蛋白濃度，根據標本蛋白濃度計算上樣量，使每孔蛋白上樣量一致;行 SDS-PAGE凝膠電泳后電轉移至硝酸纖維素濾膜上;將膜用5%的脫脂奶粉封閉后，加入抗IL-6單克隆抗體(稀釋度1∶500)，室溫孵育1 h;洗膜后加入二抗鼠抗兔IgG(稀釋度1∶1 000)室溫孵育1 h;PBST充分洗滌后，用化學發光顯影藥盒顯影，X線膠片曝光記錄影像;凝膠成像分析系統分析膠片，讀取各目的條帶及β-action的光密度值，計算其比值。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件，所有數據以±s表示，計量資料比較t檢驗，多組均數間比較采用方差分析和q檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 睡眠生理指標 見表1。

表1 三組睡眠生理指標比較(n=6，±s)

表1 三組睡眠生理指標比較(n=6，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05

組別 AI(次/h) AHI(次/h) 最低SaO2(%)治療組 14.33 ±1.37＊△ 20.17 ±1.47＊△ 78.89 ±1.03＊△模型組 17.50 ±1.87* 23.00 ±1.41* 75.69 ±0.58*對照組2.35 ±0.10 3.13 ±0.20 89.60 ±2.75

2.2 血清學指標 見表2。

表2 三組血清學指標比較(n=6，±s)

表2 三組血清學指標比較(n=6，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.01，▲P ＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05

組別 血糖(mmol/L)胰島素(pmol/L)胰島素原(pmol/L)HOMA-IR治療組 7.50 ±0.75▲△ 4.78 ±0.71▲△ 0.44 ±0.04▲△ 1.59 ± 0.25▲△模型組 11.94 ±2.51*103.18 ±6.20* 9.49 ±1.03* 54.97 ±13.09*對照組5.33 ±0.71 3.70 ±0.51 0.37 ±0.64 0.88 ± 0.13

2.3 IL-6mRNA及IL-6蛋白表達 見表3及圖1、圖2。

表3 三組IL-6mRNA及蛋白比較(n=6，±s)

表3 三組IL-6mRNA及蛋白比較(n=6，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.01，▲P ＜0.05;與模型組比較，△P ＜0.05

組別 IL-6mRNA IL-6蛋白治療組 0.86±0.05▲△ 0.82±0.05▲△模型組 1.20 ±0.03* 1.23 ±0.10*對照組0.41 ±0.08 0.73 ±0.06

圖1 各組脂肪組織IL-6 mRNA表達

圖2 各組脂肪組織IL-6蛋白表達

3 討論

OSAHS的病理生理學相當復雜，發病機制尚未完全明確，其有效的治療方法是當前的研究熱點。研究證實，肥胖和高胰島素血癥是OSAHS主要發病環節之一。脂肪細胞因子在胰島素抵抗以及代謝綜合征組分疾病的發生、發展中起重要作用，IL-6是近年研究熱門的一種脂肪源性細胞因子，是肥胖與高胰島素血癥、胰島素抵抗聯系的關鍵［2，3］。是否可通過調節OSAS患者體內IL-6水平而改善OSAS患者 AHI、AI、HI、最低血氧飽和度等指標，從而改善臨床癥狀是本實驗的一個思路，目前國內外此方面的探討很少。

IL-6是一種多功能細胞因子，具有廣泛生物學活性，在機體炎癥反應、免疫應答、造血調控和腫瘤免疫中起重要作用。它的失調與多種臨床疾病有關。IL-6代謝紊亂可能是一個影響OSAHS發生、發展的因素。近幾年關于IL-6與OSAHS間關系的研究多集中在IL-6作為炎癥介質或氧化應激標記物在體內的變化，IL-6主要由免疫細胞分泌［4］。最近研究表明，脂肪組織等非免疫細胞亦可產生IL-6，在脂質化物代謝中發揮重要作用。IL-6是受激素調節的脂肪細胞因子，腎上腺皮質激素和雌激素可抑制其產生，而兒茶酚胺可刺激其生成。OSAHS患者AHI增加，夜間血氧飽和度下降，進而引起交感神經興奮、兒茶酚胺類物質升高、血壓波動，這些均可導致IL-6水平升高。近來，發現IL-6對生理睡眠有調節作用，可減少動眼睡眠、改變慢波睡眠，使人嗜睡、易疲乏，注意力不集中。王曾等［5］發現OSAHS患者血漿IL-6水平較正常對照組明顯升高，且與病情呈正相關。另外，Kopp等［6］發現IL-6與胰島素抵抗顯著相關，可引起肥胖相關的胰島素抵抗。

我們前期研究發現，噻唑烷二酮類藥物可通過調節瘦素、脂聯素、抵抗素等脂肪細胞因子的水平而增強胰島素的敏感性，減輕胰島素抵抗［7］。本實驗在前期研究的基礎上對實驗動物予羅格列酮干預后觀察對脂肪源性細胞因子IL-6 mRNA及蛋白表達的影響，發現模型組與對照組比較AI、AHI升高，最低血氧飽和度SaO2下降，符合OSAHS患者的診斷標準;同時血糖、胰島素、胰島素原、HOMA-IR等指標均升高，提示OSAS存在高血糖、高胰島素血癥及胰島素抵抗等并發癥;模型組與對照組比較脂肪組織IL-6 mRNA及蛋白表達灰度值均升高，提示OSAS可導致IL-6水平升高。治療組與模型組比較IL-6 mRNA及蛋白表達灰度值均降低，血糖、胰島素、胰島素原、HOMA-IR、AI、AHI均降低，SaO2升高。提示羅格列酮可能通過減輕胰島素抵抗，降低脂肪組織IL-6 mRNA及蛋白表達，從而發揮其對OSAS的干預作用，降低OSAS疾病并發癥的發生率。

綜上所述，羅格列酮對OSAHS有治療作用，其機制可能為減輕胰島素抵抗，降低IL-6 mRNA及IL-6蛋白表達。

［1］徐斌，張文麗，尹彤，等.聚丙烯酰胺水凝膠注射法制備中國小型豬睡眠呼吸暫停動物模型的可靠性評價［J］.中國臨床康復，2004，8(27):5866-5867.

［2］Kershaw EE，Fliter JS.Adipose tissue as an endocrine organ［J］.Clin Endocrinol Metab，2004，89(7):2548-2556.

［3］中華醫學會呼吸病學分會睡眠呼吸疾病學組.阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診治指南(草案)［J］.中華內科雜志，2003，42(8):594-597.

［4］羅少華，高興林，李東風，等.阻塞性睡眠呼吸暫停患者循環內皮細胞與血清腫瘤壞死因子-α、白介素-6濃度的關系［J］.實用醫學雜志，2010，26(14):2508-2510.

［5］王曾，杜黎明，李京合.阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征與血漿瘦素和白細胞介素6關系的臨床研究［J］.中國醫師雜志，2006，8(8):1017-1018.

［6］Kopp HP，Kopp CW，Festa A，et al.Impact of weight loss on inflammatory proteins and their association with the insulin resistance syndrome in morbidly obese patients［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23(6):1042-1047.

［7］蘇珂，龍艷，于健，等.吡格列酮對2型糖尿病并發心血管病患者血清脂聯素與胰島素抵抗的影響.中國老年學雜志，2007，27(4):345-346.