結腸癌細胞總RNA負載成熟樹突細胞體外誘導抗腫瘤作用

楊 蕾 趙建軍 霍 銳 姜 洋

(吉林大學中日聯誼醫院內鏡中心，吉林 長春 130033)

樹突細胞(DC)作為體內功能最強大的專職抗原遞呈細胞，可以將負載于其上的腫瘤信息傳遞給免疫系統，激發抗腫瘤反應來制備腫瘤疫苗〔1〕。本研究采用結腸癌細胞株總RNA轉染成熟DC(mDC)制備結腸癌疫苗，并觀察體外誘導的抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 兔抗人癌胚抗原(CEA)抗體、異氰硫酸熒光素(FITC)標記的CD83單抗(Bioscience);白細胞介素(IL)－2、IL－4、粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子(GM－CSF)、腫瘤細胞壞死因子－α(TNF－α)(Peprotech);IL－12、干擾素(IFN)－γ 檢測試劑盒(上海森雄公司);Fermentas體外轉錄試劑盒(MBI);CEA mRNA體外轉錄載體(pcDNA3.1－CEA)、CEA表達陽性的結腸癌細胞株SW480細胞株、宮頸癌Hela細胞株(吉林大學中日聯誼醫院中心研究室保存)。

1.2 方法

1.2.1 外周血DC體外誘導與培養 Ficoll密度梯度分離法獲得健康人新鮮血外周血單個核細胞，貼壁獲得單核細胞，未貼壁細胞作為同種異體T細胞凍存備用。用GM－CSF、IL－4細胞因子組合培養單核細胞5 d，將其誘導為未成熟DC(imDC);5 d后加入含TNF－α 10 ng/ml的IMDM繼續培養24 h，流式細胞儀檢測細胞表型CD83，以未加抗體的DC細胞作為對照〔2〕。

1.2.2 腫瘤細胞總RNA提取及定量 取對數生長期SW480細胞，Trizol法提取總RNA，并用分光光度計定量。RNA濃度(mg/L)=A260×稀釋倍數×40。

1.2.3 CEA mRNA體外轉錄 以線性化的pcDNA3.1－CEA為模板，按照Fermentas體外轉錄試劑盒說明書方法體外轉錄為CEA mRNA。

1.2.4 腫瘤細胞總RNA體外負載DC 取mDC 1×106個，按照10 μg總RNA:2×106DC的比例，調電壓500 V、1 ms進行電穿孔。穿孔后置入4℃冰箱靜置10 min，移入含 GM－CSF 400 U/ml、IL－4 250 ng/ml的 IMDM 培養基中〔3〕，37℃、5%CO2飽和濕度條件下繼續培養12 h作為轉染組DC。未進行電穿孔的mDC作為未轉染組DC。

1.2.5 免疫細胞化學染色法檢測mDC內CEA蛋白表達 分別收集轉染組DC和未轉染組DC，滴入多聚賴氨酸包被的載玻片，用冷丙酮固定。按照免疫細胞化學染色試劑盒說明書方法檢測DC內CEA蛋白表達。

1.2.6 SW480總RNA負載DC后體外誘導細胞毒T淋巴細胞(CTL)及特異性細胞毒實驗 效應細胞:取轉染組DC，調細胞密度為5×105/ml，同種異體淋巴細胞調細胞密度為2×106/ml，各取 400 μl于 24 孔板共同培養，并于第 1、3、5 天各加入IL－2 1 ng/ml;第7天再次加入轉染組DC刺激5 d，以誘導CTL作為第一組效應細胞(SW480－CTL)。收集轉染10 μg CEA mRNA的DC，按照上述方法誘導CTL作為第二組效應細胞(CEA－CTL)。未轉染組DC按上述方法與同種異體淋巴細胞共同培養獲得的細胞作為對照組效應細胞。靶細胞:轉染CEA mRNA的DC作為靶細胞1;SW480細胞作為靶細胞2;Hela細胞作為靶細胞3。

按效靶比 40∶1、20∶1、10∶1、5∶1將各組效應細胞與靶細胞混合并加入96孔板，每組設3個復孔，分別作為實驗孔，37℃、5%CO2孵育5 h，按乳酸脫氫酶(LDH)比色法試劑盒說明書操作，用分光光度計在510 nm處檢測吸光值。只分別加入靶細胞的為自然釋放孔，只分別加入靶細胞后再加入Triton X－100裂解細胞的為最大釋放孔。

殺傷率(%)=〔(實驗孔OD－自然釋放孔OD)/(最大釋放孔－自然釋放孔OD〕×100%

1.2.7 ELISA法檢測誘導的CTL分泌IFN－γ水平 收集方法

1.2.6中的第一組效應細胞和未轉染組DC誘導的對照組效應細胞上清各100 μl，加入96孔酶標板，每組設3個復孔，用IFN－γ試劑盒分別檢測上清中IFN－γ水平。

1.3 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件分析，組間數據比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 體外誘導的DC形態學觀察及表型檢測 mDC脫壁懸浮，體積增大不規則，有特征性毛刺狀突起，部分細胞聚集成簇。流式細胞術檢測DC成熟標志CD83表達陽性。

2.2 SW480細胞總RNA提取及CEA mRNA體外轉錄 提取的RNA經瓊脂糖凝膠電泳顯示有28S、18S、5S三條帶，說明提取的RNA完整，A260/A280=1.9，說明RNA純度較高，RNA濃度為0.2 mg/L。轉錄后的CEA mRNA在1 200～2 000 bp之間出現大小不等條帶，與CEA理論長度相符。見圖1。

2.3 免疫細胞化學染色檢測結果 轉染組DC內胞質染成棕黃色，而對照組沒有。由于SW480是CEA特異性表達細胞，既然CEA在DC內表達成功，也可以認為SW480細胞總RNA能在DC內表達。見圖2。

2.4 轉染腫瘤總RNA的DC誘導的腫瘤特異性細胞毒效應

負載SW480總RNA的DC誘導的CTL和負載CEA mRNA的DC誘導的CTL均能特異性殺傷有CEA蛋白表達的兩種靶細胞，即CEA靶細胞和SW480靶細胞，兩種CTL對CEA靶細胞的殺傷率無顯著性差別，但負載SW480的DC對SW480靶細胞的殺傷率顯著大于負載CEA的DC的殺傷率(P＜0.01)。各組效應細胞對靶細胞均無殺傷作用。見圖3。

2.5 轉染SW480總RNA的DC誘導CTL分泌IFN－γ 轉染SW480總RNA的DC體外誘導的CTL上清中IFN－γ分泌量〔(142.646 7±23.997 8) pg/ml〕顯著高于對照組〔(35.946 67 ±6.112 6)pg/ml〕水平(P ＜0.01)。

圖1 pcDNA3.1-CEA體外轉錄為CEA mRNA的電泳圖

圖2 免疫細胞化學染色檢測轉染后DC內CEA蛋白的表達(×400)

圖3 轉染SW480總RNA的DC誘導的特異性細胞毒效應

3 討論

由于DC在抗原提呈過程中的特殊地位，用不同方法使之負載腫瘤抗原，誘導機體抗腫瘤免疫應答來制備腫瘤疫苗，是治療腫瘤的一條有效途徑，并且在近年來成為腫瘤免疫治療的研究熱點之一〔4〕。有關結腸癌DC疫苗的研究中有兩個關鍵問題，即選擇負載的腫瘤抗原及選擇不同成熟階段的DC。CEA是一種腫瘤相關抗原，在結腸腺癌中高表達，一般用來作為結腸癌治療的靶目標，目前研究最多的是用CEA多肽負載DC，在幾種抗腫瘤免疫治療的體內外實驗中均取得了一定的效果〔5〕;但多肽的應用需鑒定人類白細胞抗原(HLA)分型，程序繁瑣，且腫瘤細胞容易通過腫瘤變異逃避這種針對單一抗原表位的免疫反應，使其在臨床的應用受到限制〔6〕。本研究采用了該領域中最新的核酸疫苗方法，用結腸癌細胞株的總RNA負載DC來制備腫瘤疫苗，其應用的優勢在于:①與傳統疫苗相比，能激發機體更全面的免疫應答，表達的抗原肽更接近天然構象，抗原性更強。②RNA轉染只需進入胞質，轉染效率較高，對DC損傷較小，有利于保持DC的活性及提呈功能。③RNA可以編碼腫瘤抗原與不同的HLA等位基因結合的多個表位，因此應用不受HLA限制。④與其他全腫瘤疫苗需大量腫瘤組織來制備的方法相比，RNA可從少量腫瘤組織中分離并擴增而充足的獲得〔7〕，使RNA疫苗可以應用于那些術后或腫瘤負荷很小的患者，因此更有臨床應用前景。

DC在分化成熟過程中分為兩個階段，未受到抗原刺激時，大部分處于非成熟階段，有強大的抗原攝取功能;在攝取抗原或受到刺激后分化為mDC，高表達人主要組織相容性復合體Ⅰ類(MHC－Ⅰ)、MHC－Ⅱ及共刺激分子，分泌T細胞激活所需的各種細胞因子，具有強大的抗原遞呈及T細胞激活功能。本研究中創新性地采用了mDC作為載體，以避免既往研究中應用imDC可能產生的免疫耐受或低免疫原性反應〔8〕;并采用電穿孔法，大大地提高了轉染效率，免疫細胞染色法及流式細胞術均證實SW480總RNA能在mDC內表達，隨后進行的抗腫瘤作用實驗結果表明轉染CEA mRNA的DC和轉染SW480總RNA的DC誘導的效應細胞均能殺傷CEA靶細胞，且兩者對CEA靶細胞的殺傷率無顯著性差別，表明SW480總RNA群中的CEARNA足夠激發CEA特異性的細胞毒效應。結果還表明轉染SW480總RNA的DC能特異性殺傷SW480靶細胞，即其能夠產生腫瘤特異性的CTL，雖然負載CEA的DC誘導的CTL也能特異性殺傷SW480靶細胞，但其殺傷率顯著低于SW480－CTL的殺傷率。這一結果又與以下假設相符，即SW480細胞中除了CEA蛋白外，還有許多其他未知的腫瘤抗原刺激T細胞反應，而負載CEA的DC僅能誘導CEA特異性的T細胞反應。因此，用結腸細胞總RNA負載DC可以作為一種新型結腸癌免疫治療策略，誘導針對更多未知腫瘤抗原的更全面的抗腫瘤效應。

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2 楊 蕾，霍 銳，卜麗梅，等.結腸癌細胞總RNA電穿孔法體外轉染成熟樹突狀細胞〔J〕.吉林大學學報(醫學版)，2009;35(2):271－5.

3 Schaft N，D?rrie J，Thumann P，et al.Generation of an optimized polyvalent monocyte－derived dendritic cell vaccine by transfecting defined RNAs after rather than before maturation〔J〕.J Immunol，2005;174(5):3087－97.

4 Joffre O，Nolte MA，Sp?rri R，et al.Inflammatory signals in dendritic cell activation and the induction of adaptive immunity〔J〕.Immunol Rev，2009;227(1):234－47.

5 Itoh T，Ueda Y，Kawashima I，et al.Immunotherapy of solid cancer using dendritic cells pulsed with the HLA－A24－restricted peptide of carcinoembryonic antigen〔J〕.Cancer Immunol Immunother，2002;51(2):99－106.

6 Renkvist N，Castelli C，Robbins PF，et al.A listing of human tumor antigens recognized by T cells〔J〕.Cancer Immunol Immunother，2001;50(1):3－15.

7 Steinman RM，Nussenzweig MC.Avoiding horror autotoxicus:the importance of dendritic cells in peripheral T cell tolerance〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2002;99(1):351－8.

8 Javorovic M，Pohla H，Frankenberger B，et al.RNA transfer by electroporation into mature dendritic cells leading to reactivation of effector－memory cytotoxic T lymphocytes:a quantitative analysis〔J〕.Mol Ther，2005;12(4):734－43.