骨髓間充質干細胞移植對老年癡呆大鼠的防治作用

王思淼 劉麗萍 王曉斐 陳玉丙 (吉林大學公共衛生學院，吉林 長春 300)

老年性癡呆(senile dementia)是廣泛性大腦皮質萎縮引起的以功能減退和行為、性格障礙為主的老年期常見病，發病率隨著年齡的增高而增加〔1〕。目前，我國老年癡呆患病人數在600萬人左右，預計2030年將增至1 200萬人〔2〕，已成為嚴重威脅老年人健康的四大疾病之一。提高老年人的生存質量，預防、治療和減少老年癡呆的發生已成為當今世界研究的重點。

1 材料與方法

1.1 試劑及動物 DMEM培養基(Gibco公司)，胰蛋白酶、β－淀粉樣蛋白多肽(Sigma公司)，PCR試劑盒、RNA提取試劑盒(Takara公司)，ELISA試劑盒(上海西唐公司)。清潔級健康Wistar乳鼠，體重 (12±2)g。清潔級健康 Wistar大鼠，體重(350±20)g，由吉林大學實驗動物中心提供。

1.2 骨髓間充質干細胞(BMSCs)培養 無菌取出Wistar乳鼠股骨，注射器吸取培養基沖出骨髓，200目濾網過濾，制備成單細胞懸液，調細胞濃度1×105/ml，接種到培養瓶中，37℃，5%二氧化碳培養箱中培養，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況。待細胞長至80%時，胰蛋白酶消化進行傳代，細胞傳至3代時備用。

1.3 動物模型制備 Wistar大鼠麻醉，剪去顱頂部毛，腦立體定位儀固定頭部，常規消毒皮膚，在顱頂中線縱向開口，暴露顱骨。腦立體定位，前囟后3.0 mm，分別向中線左右各旁開2.2 mm，鉆開顱骨，垂直進針 2.8 mm，將 1 μl的 Aβ1－40(造模前用無菌生理鹽水將 Aβ1－40稀釋成 10 μg/μl，37℃ 下孵育 1 w，使其變為凝聚態的Aβ)緩慢注入海馬區，留針5 min后緩慢撤針。清潔顱骨，縫合皮膚。

1.4 RT－PCR方法檢測腦源性神經生長因子(BDNF)的表達BMSCs移植組在制備模型前第1天回輸靜脈BMSCs，BMSCs濃度為1×106/ml，每只鼠回輸1 ml。PBS輸入組回輸PBS，模型組、PBS輸入組與 BMSCs移植組分別注射 Aβ1－40，對照組正常飼養。制備模型8 w后取海馬組織，RT－PCR方法檢測BDNF基因的表達。使用RNA提取試劑盒提取總RNA，BDNF引物序列:上游 5′GTGACAGTATTAGCGAGTGGG3′，下游 5′TATCCTTATGAACCGCCAGCC3′，片段大小為278 bp。GAPDH引物序列:上游 5′ACCACAGTCC ATGCCATCAC3′，下游 5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′，片段大小為 462 bp;RT－PCR 反應后行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.5 ELISA檢測神經生長因子(NGF)的含量 取各組大鼠海馬組織，組織勻漿離心后，ELISA試劑盒檢測NGF的表達，按說明書進行操作，酶標儀在450 nm處檢測吸光值。

1.6 統計學處理 采用SPSS14.0統計軟件包進行t檢驗。

2 結果

2.1 BMSCs的分離培養 采用全骨髓貼壁法分離培養的BMSCs，形態呈長梭形。顯微鏡下觀察，接種后3 d可見少量細胞貼壁，軸突伸出;5 d呈多邊形或梭狀，7 d可見集落形成。經3次傳代后，細胞呈單一的長梭形生長，排列呈束狀。見圖1。

圖1 顯微鏡下觀察BMSCs

圖2 RT-PCR方法檢測BDNF的表達

2.2 RT－PCR方法檢測BDNF的表達 BMSCs移植組的BDNF表達明顯高于模型組及PBS輸入組，差異具有統計學意義(P＜0.05)。BMSCs移植組的BDNF表達接近于正常對照組(P＞0.05)。模型組的 BDNF表達低于正常對照組(P＜0.05)。見圖2。

2.3 ELISA檢測NGF的含量 BMSCs移植組的NGF表達(71.50±6.18)明顯高于模型組(48.16±9.28)及PBS輸入組(47.16±7.35)，差異有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01);BMSCs移植組的NGF表達雖高于正常對照組(64.33±4.50)，但差異無統計學意義(P＞0.05)。提示BMSCs移植老年癡呆模型大鼠可使NGF的表達量增加。

3 討論

老年癡呆的病因和發病機制迄今尚不明確。BDNF是神經營養因子家族主要成員之一，對神經元的生長發育、分化和損傷修復成熟起著至關重要的作用〔3〕。BDNF能促進突觸的可塑性，包括增加突觸終末的密度，促進樹突和軸突的長出〔4～6〕。NGF是神經系統中最重要的生物活性分子之一，是一種具有神經元營養活性的因子，對中樞與周圍神經的損傷有保護和恢復的作用〔7〕。

BMSCs是一種具有自我復制能力和多分化潛能的細胞，能夠在體外不同的培養條件下分化成不同亞型的神經元和膠質細胞〔8〕。BMSCs在體內也可分化為神經細胞〔9〕。實驗表明，在移植的BMSCs動物模型中，BDNF、NGF表達量增加，可使神經元得到保護并引起神經再生效應。BMSCs在治療缺血性腦損傷時能在腦中成活并向缺血部位遷移，參與血管組織修復〔10〕。遷移至病變部位的 BMSCs與損傷宿主神經組織間的相互作用，可使BDNF、NGF等因子的表達增加，這些細胞因子對神經功能的恢復發揮積極的作用。因此，BMSCs移植就成為防治老年癡呆的一個選擇方案，為預防和減少老年癡呆的發生帶來新的希望。

1 張微微，周小英.阻斷老年癡呆的進展－阿爾茨海默病的治療現狀〔J〕. 中老年保健，2005;145(11):10－1.

2 張 慧，尚少梅.老年癡呆病人生活質量的研究現狀〔J〕.護理研究，2008;22(7):1694－5.

3 蔣 暉，金大地，瞿東濱，等.腦源性神經營養因子基因修飾神經干細胞對體外培養的脊髓背根神經節細胞的生物學作用〔J〕.中華外科雜志，2005;43:1609－12.

4 Waterhouse EG，Xu B.New insights into the role of brain－derived neurotrophic factor in synaptic plasticity〔J〕.Mol Cell Neurosci，2009;42:81－9.

5 Gao X，Smith GM，Chen J.Impaired dendritic development and synaptic formation of postnatal－born dentate gyrus granular neurons in the absence of brain－derived neurotrophic factor signaling〔J〕.Exp Neurol，2009;215:178－90.

6 Chapleau CA，Carlo ME，Larimore JL，et al.The actions of BDNF on dendritic spine density and morphology in organotypic slice cultures depend on the presence of serum in culture media〔J〕.J Neurosci Methods，2008;169:182－90.

7 徐 清，趙冬梅，黃 飛，等.神經生長因子神經保護作用的研究進展〔J〕. 濱州醫學院學報，2007;30(1):43－6.

8 Bossolasco P，Cova L，Calzarossa C，et al.Neuro－glial differentiation of human bone marrow stem cells in vitro〔J〕.Exp Neurol，2005;193(2):312－25.

9 Brazelton TR，Rossi FM，Keshet GI，et al.From marrow to brain:expression of neuronal phenotypes in adult mice〔J〕.Science，2000;290(5497):1775－9.

10 劉麗萍，那漢榮.骨髓間充質干細胞移植對腦缺血模型大鼠記憶功能的影響〔J〕. 中國老年學雜志，2011;31(15):2910－1.