電針智三針對血管性癡呆大鼠學習記憶能力及β－淀粉樣蛋白表達的影響

唐中生 陸 瑩 宋 華 謝高宇 羅亞非 張作濤 (貴陽中醫學院解剖學教研室，貴州 貴陽 550002)

血管性癡呆 (VD)是指由于腦血管疾病和心血管病變的原因，因缺血性組織缺氧和出血性腦損害所導致的認知喪失〔1〕，VD患者有明顯的記憶、思維、計算、定向、判斷等能力障礙，已成為威脅高齡人群生命的重要疾病之一。β-淀粉樣蛋白 (Aβ)是淀粉蛋白前體的降解產物，是腦組織內老年斑形成的物質基礎。Aβ并非Alzheimer病所特有，也可見于VD。臨床研究表明〔2〕，Aβ在血管性癡呆的發病機制中可能起了一定的作用。有關電針治療VD之后血漿Aβ變化及其機制的報道還未見到。本研究探討電針治療VD的可能機制，為電針治療VD提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 健康SD大鼠60只，雌雄各半，體重280～300 g，清潔級，由貴州省實驗動物研究中心提供，合格證號:SCXK(黔)2002-0001。

1.2 實驗器材 電子天平 (蘇州精密儀器廠);g6805-1a電針治療儀 (上海華誼醫用儀器廠);80-2離心沉淀器 (上海手術器械廠);Dig Behv Morris水迷宮視頻分析系統 (上海吉量軟件科技有限公司);掀針 (蘇州醫療用品廠有限公司)等。

1.3 藥品與試劑 硝普納 (北京制藥工業研究所實驗藥廠);Aβ試劑盒 (南京建成生物工程研究所)。尼莫地平 (正大青春寶藥業有限公司，批號:0801002)

1.4 實驗方法

1.4.1 VD大鼠動物模型的建立 將動物隨機分為假手術組、模型組、電針組和尼莫地平組，采用改良的Pulsinelli四血管阻斷法 (4-VO)建立VD大鼠模型〔3〕。采用10%的水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔麻醉，行背側頸正中切口，用電凝針燒灼雙側第一頸椎翼小孔內的椎動脈，造成永久性閉塞。再行腹側頸正中切口，分離雙側頸總動脈，穿線備用。24 h后用微動脈夾夾閉雙側頸總動脈5 min，共夾閉3次，每次間隔1 h。假手術組處理步驟同上，但不進行椎動脈燒灼和頸總動脈夾閉。模型制作成功標準:大鼠在4條血管阻斷后1～2 min內，翻正反射消失，虹膜變白及瞳孔散大。

1.4.2 治療方法 術后第7天開始治療，治療均在每天上午9:00～11:00進行，每日1次，連續治療20 d。

1.4.2.1 電針組 根據針灸學中“人身處處皆是穴”的理論，參考華興邦《大鼠穴位圖譜》，按照人體結構與大鼠結構的比例和人體穴位的定位，以百會穴為參照點，于大鼠百會穴正中前下方2 mm處取神庭，神庭穴兩側旁開0.5 mm處取本神，然后以28號1寸毫針于大鼠神庭、本神三穴捻入0.5寸，連接電針儀，施以連續波，頻率150 Hz，20 min后出針。

1.4.2.2 尼莫地平組 尼莫地平配成0.18% (g/ml)濃度的溶液，1 ml/只灌胃。

1.4.2.3 假手術組、模型組 均給予蒸餾水1 ml/100 g灌胃。

1.4.3 Morris水迷宮學習記憶能力檢測〔4〕各組大鼠于術后第28天開始水迷宮測試。第1～6天進行定向航行實驗，每日將大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限的順序從各入水點 (各象限水池壁中點)靠池壁放入水中，記錄60 s內大鼠從水中爬上站臺所需時間為逃避潛伏期;第7天行空間探索實驗，將大鼠從第Ⅰ象限入水點放入水池，記錄2 min內大鼠在第Ⅲ象限游泳時間和穿越站臺次數。數據由電腦自動采集。

1.4.4 血漿采集及檢測 Morris水迷宮檢測之后，于腹股溝處切開皮膚，剪斷股靜脈采集血液，肝素抗凝，靜置后離心分離血漿，進行Aβ含量檢測。然后開顱取腦，保留含有海馬和大腦皮質的組織后固定12 h。經梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋后，連續冠狀切片，蘇木素-伊紅 (HE)染色，光鏡觀察海馬和大腦皮質神經元的病理變化。

1.5 圖像分析及統計學處理 用Biomias99圖像分析系統進行圖像分析。實驗數據以±s表示，采用SPSS19.0統計軟件進行一元方差分析，LSD檢驗及單因素方差分析。

2 結果

2.1 各組大鼠海馬CA1區和大腦皮質病理形態學觀察 海馬CA1區:HE染色見假手術組大鼠海馬CA1區神經元排列整齊、密集，細胞結構正常，胞質豐富，無膠質細胞增生現象;細胞核呈圓形、橢圓形，無變性，無固縮或溶解現象。VD模型組海馬CA1區組織明顯水腫，出現腦梗死灶，神經元排列紊亂，體積變小，變性嚴重，胞核與胞質界限不清，部分嚴重變性壞死。電針組海馬CA1區神經元結構正常、輕微水腫，無嚴重變性。尼莫地平組海馬CA1區神經元結構正常、密集，少量水腫，無變性壞死。大腦皮質:HE染色見假手術組大腦皮質組織內無血管擴張，有輕微水腫形成，無出血，無血腫形成，無神經元變性，無神經元壞死，無膠質細胞增生，無壞死灶，無淋巴細胞浸潤。模型組大腦皮質組織出現嚴重水腫，神經元嚴重變性和壞死，膠質細胞增生明顯，大量軟化灶形成，有淋巴細胞浸潤。電針組大腦皮質組織內無血管擴張，有輕微水腫形成，無出血，無血腫形成，少量神經元變性，少量神經元壞死，無膠質細胞增生，無壞死灶，無淋巴細胞浸潤。尼莫地平組大腦皮質組織內無血管擴張，有輕微水腫形成，無出血，無血腫形成，少量神經元變性，無神經元壞死，無膠質細胞增生，無壞死灶，無淋巴細胞浸潤。見圖1。

2.2 行為學檢測結果 模型組大鼠平均逃避潛伏期與假手術組比較明顯延長 (P＜0.01)，電針組與模型組相比，平均逃避潛伏期縮短 (P＜0.01，P＜0.05)，與尼莫地平組相比無差異 (P＞0.05)。見表1。模型組與假手術組比較，第Ⅲ象限活動時間縮短、穿越站臺次數減少 (P＜0.01)，電針組與模型組比較，第Ⅲ象限活動時間延長、穿越站臺次數增多(P＜0.01)，電針組與尼莫地平組比較無差異 (P＞0.05)。見表2。

表1 各組大鼠定位航行實驗平均逃避潛伏期(±s，s)

表1 各組大鼠定位航行實驗平均逃避潛伏期(±s，s)

與假手術組比較:1)P＜0.01;與VD模型組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01

組別 n 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天假手術組 12 45.56±3.52 27.16±4.04 21.67±4.14 12.53±4.52 7.36±2.31 4.27±3.18 VD模型組 11 57.01±6.82 50.67±5.021) 45.08±6.521) 40.59±6.031) 33.28±7.031) 23.76±7.381)電針組 10 51.49±5.42 42.56±4.182) 34.32±4.632) 21.42±3.683) 18.44±3.363) 12.16±2.293)尼莫地平組 10 47.44±5.73 40.36±3.17 35.47±5.86 20.27±1.50 18.69±3.07 9.35±2.29

表2 各組大鼠空間探索實驗第Ⅲ象限活動時間和穿越站臺次數(±s)

與假手術組比較:1)P＜0.01;與VD模型組比較:2)P＜0.01

組別 n 第Ⅲ象限活動時間(s) 穿越站臺數(次)假手術組12 79.47±12.29 7.36±1.73 VD模型組 11 24.46±10.351) 1.91±0.581)電針組 10 47.63±11.522) 4.87±0.682)尼莫地平組10 50.36±10.38 4.59±1.28

2.3 各組大鼠血漿Aβ含量檢測及比較 VD模型組大鼠血漿Aβ含量比假手術組顯著升高(P＜0.01)，電針組大鼠Aβ含量雖然也明顯高于假手術組(P＜0.05)，但與VD模型組大鼠相比明顯降低(P＜0.01)，見表3。提示電針智三針可以降低VD大鼠異常升高的血漿Aβ含量。

2.4 海馬CA1區組織病理學積分 與假手術組比較，模型組海馬部位的病理積分明顯增加(P＜0.01)，電針組海馬病理積分與模型組比較顯著降低(P＜0.01)，對海馬的作用與尼莫地平組相當(P＞0.05)。這說明電針智三針可以有效改善VD大鼠已經變性壞死的神經元細胞，提高大鼠的學習記憶能力。結果見表3。

表3 各組大鼠血漿Aβ含量及海馬組織學病理積分(±s)

表3 各組大鼠血漿Aβ含量及海馬組織學病理積分(±s)

與假手術組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與VD模型組比較:3)P＜0.01

組別 n Aβ含量(ng/ml)海馬組織學病理積分假手術組 12 4.37士0.63 7.5±4.63 VD模型組 11 11.48±1.261) 36.67±5.001)電針組 10 6.21±0.262)3) 28.89±3.333)尼莫地平組 10 6.32±2.762) 24.44±5.273)

3 討論

電針治療VD的療效優于目前常用的西藥療法〔5〕?！爸侨槨庇缮裢?、本神(雙)三穴組成，主治小兒智力低下、老年性癡呆、VD、健忘等有關智力方面的疾病療效顯著，提示電針智三針能有效改善VD大鼠學習記憶能力，效果和尼莫地平相當。

各種原因誘發VD的共同通路，是VD形成和發展的關鍵因素，因此抑制和減少Aβ在腦內沉積是突破VD治療的關鍵環節。研究發現，AD患者血清Aβ含量較智能正常老年人明顯升高，且與疾病的嚴重程度呈正相關，表明AD患者可引起淀粉樣蛋白異常變化〔6〕。盧雨微等〔7〕研究表明，耳針能減少或抑制Aβ的過度產生，這可能是減少了Aβ的沉積，阻止Aβ裝備成有毒性的聚合體，保護神經元免受Aβ的神經毒性，從而改善VD模型大鼠學習記憶。維生素E(VE)可能通過調節早老蛋白(PS-1)的表達來降低Aβ的生成，從而減少神經元的損傷，起到保護作用〔8〕。表明血漿Aβ的增加對腦組織產生了毒性作用，導致了神經元的損傷和變性，電針通過下調血漿Aβ含量，減輕了對腦組織神經元的損傷和變性，增加的學習記憶的能力，且電針智三針的治療效果接近尼莫地平治療組，這提示或許可以使用電針替代尼莫地平治療，或者聯合治療對患者更有利。

1 Roman GC.Vascular dementia revisited diagnosis，pathologenesis，treatment，and prevention〔J〕.Med Clin North Am，2002;86:477-99.

2 承歐梅，鐘世江，晏 勇，等.腦卒中和血管性癡呆β淀粉樣蛋白測定及臨床意義〔J〕.重慶醫學，2004;33(4):555-6.

3 劉 燕，李衛東，苗 晉，等.電針對血管性癡呆大鼠腦組織MDA和AchE含量的影響〔J〕.天津中醫藥，2008;25(6):459-61.

4 Vorhees CV，Williams MT.Morris water maze:procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory〔J〕.Nat Protoc，2006;1(2):848-58.

5 朱蔓佳，趙 凌.張虹教授電針頭穴治療血管性癡呆經驗〔J〕.時珍國醫國藥，2009;20(10):2581-2.

6 曾凡源，鐘承彪，謝裕達，等.血清β-淀粉樣蛋白含量檢測對老年性癡呆的臨床意義〔J〕.中國醫藥導報，2009;6(24):28-9.

7 盧雨微，呂明莊，賀志光.耳穴埋針對血管性癡呆大鼠記憶障礙及β淀粉樣蛋白表達的影響〔J〕.中國針灸，2006;26(11):804-8.

8 孔亞坤，姚蘭春，盧長柱，等.維生素E對老年雌性大鼠海馬區PS-1表達和Ap生成的影響〔J〕.中國應用生理學雜志，2007;23(2):237-40.