二氮嗪對氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠海馬神經元氧化應激損傷的保護作用

孫錫波 高 茜 程 蕊 李炳選 劉學伍 遲兆富

(濰坊醫學院附屬益都中心醫院神經內科，山東 青州 262500)

目前癲癇發作導致神經元損傷或死亡的分子機制仍不完全明確，亦缺乏有效的具有神經保護作用的藥物。線粒體ATP敏感性鉀通道(mitoKATP)是存在于線粒體膜上的一種鉀通道，二氮嗪(DZ)作為其特異性開放劑，能減輕組織的缺血再灌注損傷，已在多個研究得到證實〔1～4〕。然而DZ對癲癇發作導致的神經元損傷是否具有神經保護作用，目前國內外研究還很少。本實驗我們采用氯化鋰-匹魯卡品制作大鼠顳葉癲癇持續狀態模型，用DZ及mitoKATP特異性阻斷劑5-羥基癸酸(5-HD)預處理，觀察DZ對癲癇發作后海馬神經元氧化應激的影響，探討DZ對癲癇發作是否具有神經保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年雄性Wistar大鼠66只，清潔級，體質量200～250 g，由山東大學實驗動物中心提供，隨機分為空白對照組12只，其中6只用于HE、Nissl染色，6只用于指標檢測。癲癇組(PILO組)、DZ組(DZ組)、DZ加5-HD組(DZ+5-HD組)，每組18只，后3組再分為2個亞組，每亞組6只，分別用于SE后24 h、48 h指標檢測，每組剩余的6只用于HE、Nissl染色。

1.2 儀器與試劑 氯化鋰、匹魯卡品、DZ、5-HD均購自美國Sigma公司;蘇木素-伊紅購自武漢博士德公司，甲苯胺藍購自上海生工生物工程有限公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司;全基因組DNA抽提試劑盒購自德國Qiagen公司;大鼠 8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒購自日本Shizuoka公司。

1.3 方法

1.3.1 藥物干預及癲癇模型建立 所有大鼠腹腔注射氯化鋰(127 mg/kg)，20 h后給予腹腔注射匹魯卡品30 mg/kg，在匹魯卡品處理前30 min給予皮下注射氫溴酸東莨菪堿1 mg/kg，以拮抗匹魯卡品導致的外周膽堿能反應。DZ組于注射匹魯卡品前15 min給予DZ 5 mg/kg，腹腔內注射。DZ+5-HD組于注射匹魯卡品前20 min先給予5-HD 8 mg/kg，間隔5 min后再給予DZ 5 mg/kg，二者皆腹腔內注射。對照組用等量的生理鹽水代替匹魯卡品。觀察大鼠的行為學改變，以Racine評分標準為依據來判定癲癇發作級別，發作達到Ⅳ或Ⅴ級的大鼠歸為實驗組。如果有的小組中大鼠被排除，則即補充相應數量的大鼠，以保證每組的樣本量。大鼠SE持續60 min以后，通過腹腔注射地西泮10 mg/kg以終止發作。

1.3.2 取材 分別在致癇后24 h、48 h，用10%的水合氯醛100 mg/kg，將大鼠麻醉后，斷頭處死，迅速取出腦組織，在低溫修塊臺上快速分離出雙側海馬，新鮮海馬組織置于－80℃保存備用，用于MDA、SOD、GSH-Px的檢測及海馬 DNA 8-OHdG的測定。用于HE染色及Nissl染色的大鼠于SE后48 h，用10%的水合氯醛100 mg/kg，將大鼠麻醉后，4%多聚甲醛主動脈灌注固定，斷頭取腦，放入固定液中后固定24 h，取海馬組織塊，脫水至蠟23 h，石蠟包埋。

1.3.3 HE染色及Nissl染色 在切片機做連續冠狀切片，切片厚度為10 μm，在溫水槽內展片，再撈于已用鉻礬明膠包被的清潔載玻片上，在切片臺上烤片2 h后，4℃保存備用。切片每隔5張取2張組成1套，每套約8～10張，行HE染色及Nissl染色。將組織染色切片置于光學顯微鏡下，觀察大鼠海馬CA1區、CA3區神經元的形態及其分布。每個標本取6張染色切片，行海馬神經元計數，每張切片各部位均隨機觀察5個視野，取其平均值。

1.3.4 MDA、SOD、GSH-Px的檢測 取一側海馬組織，稱重，按組織與生理鹽水1∶9(W/V)的比例，置于玻璃勻漿器冰浴研磨，制備10%的組織勻漿。3 000 r/min，離心10 min，離心半徑10 cm，移液管取上清液。嚴格按照試劑盒說明書操作，分別采用硫代巴比妥酸比色法檢測海馬組織中MDA的含量，WST-1法檢測SOD的活力，紫外比色法檢測GSH-Px的活力。

1.3.5 海馬DNA 8-OHdG的測定 海馬組織總DNA的提取按照試劑盒說明書操作，用8-OHdG ELISA試劑盒測定大鼠海馬DNA中8-OHdG的含量，該試劑盒能測量極低水平的8-OHdG的含量，所有微板接受450 nm光密度測定。8-OHdG ELISA重復3次，取其均值。結果基于每次8-OHdG標準溶液試驗的線形校正曲線計算，所得數據以每微克DNA所含的8-OHdG的皮克數表示。

1.4 統計學處理 采用SPSS16.0軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示，計數數據采用百分比表示，兩樣本均數比較采用t檢驗，多個樣本均數比較選擇單因素方差分析，其中兩兩間比較采用最小顯著差檢驗，率的比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 行為學表現 對照組大鼠無癲癇發作。PILO組致癇成功率83.33%(15/18)，DZ組的致癇率為77.78%(14/18)，DZ+5-HD組的致癇率為83.33%(15/18)，3組間無顯著性差異(P＞0.05)。注射匹魯卡品到癲癇持續狀態的潛伏期PILO組為16～62 min，平均(37.83±15.64)min;DZ+5-HD組的潛伏期為19～58 min，平均(36.25±16.85)min;DZ組的潛伏期為27～96 min，平均(60.54±19.68)min。DZ組的潛伏期較PILO組以及DZ+5-HD組顯著延長(P＜0.05)。致癇24 h時，15只PILO組大鼠死亡5只，死亡率為33.33%;DZ+5HD組死亡4只，死亡率為26.67%;DZ組無死亡。DZ組死亡率分別與PILO組和DZ+5-HD組差異顯著(P＜0.05)。

2.2 HE染色及Nissl染色 正常對照組大鼠海馬CA1區和CA3區可見大量致密的錐體細胞，排列整齊，細胞結構清晰完整，邊緣清晰，細胞結構正常，染色質分布均勻，胞漿內尼氏小體豐富。SE后大鼠海馬神經元損傷明顯，可見部分神經元脫失，細胞排列紊亂，細胞結構不完整，胞質濃縮，核固縮，染色質凝集成塊，邊集，胞漿內尼氏小體減少。SE后48 h大鼠海馬CA1區和CA3區存活的神經元數較對照組明顯減少，差異有統計學意義(P＜0.05)，DZ組大鼠海馬CA1區和CA3區存活的神經元數目較PILO組明顯增加，差異有統計學意義(P＜0.05)，DZ+5-HD組存活的神經元數目與PILO組比較無顯著性差異(P＞0.05)，見表1。

2.3 MDA、SOD、GSH-Px檢測 PILO組及 DZ+5HD組大鼠MDA含量在SE發作后24 h、48 h均較對照組顯著升高(P＜0.05);SOD與 GSH-Px活力在SE后24 h、48 h均顯著下降(P＜0.05)。DZ組大鼠，在SE后各時間點海馬MDA含量均明顯低于PILO組與DZ+5HD組大鼠(P＜0.05)，海馬SOD與GSH-Px活力在SE后24 h、48 h時顯著高于PILO組與DZ+5HD組 (P＜0.05)，見表2。

2.4 海馬DNA 8-OHdG的測定 PILO組及DZ+5HD組大鼠海馬DNA 8-OHdG的含量在SE發作后24 h、48 h均較對照組顯著升高(P＜0.05);DZ組大鼠，在SE后各時間點海馬DNA 8-OHdG的含量均明顯低于PILO組與DZ+5HD組大鼠(P ＜0.05)，見表2。

表1 Nissl染色各組大鼠海馬CA1和CA3區存活的錐體細胞數(個/mm2，±s，n=6)

表1 Nissl染色各組大鼠海馬CA1和CA3區存活的錐體細胞數(個/mm2，±s，n=6)

與對照組比較:1)P＜0.05;與PILO組及DZ+5-HD組比較:2)P＜0.05

組別 CA1區 CA3區對照組238.5±23.5 257.5±24.8 PILO組 103.4±11.51) 114.6±12.81)DZ組 198.7±18.32) 218.3±22.52)DZ+5-HD組 105.6±11.21) 116.8±12.71)

表2 各組大鼠海馬MDA、SOD、GSH-Px、DNA 8-OHdG的比較(±s，n=6)

表2 各組大鼠海馬MDA、SOD、GSH-Px、DNA 8-OHdG的比較(±s，n=6)

與對照組比較:1)P＜0.05;與同時間點PILO組及DZ+5-HD組比較:2)P＜0.05

組別 MDA(nmol/mg蛋白) SOD(U/mg蛋白) GSH-Px(U/mg蛋白) 8-OHdG(pg/μg DNA)對照組 13.76±2.26 195.37±13.35 69.35±8.47 5.56±0.93 SE后24 h PILO組 23.87±3.941) 170.45±16.781) 46.58±6.341) 63.34±9.621)DZ組 18.46±2.572) 183.24±17.162) 58.86±11.252) 26.45±3.792)DZ+5-HD組 23.47±4.551) 172.48±14.581) 47.35±6.821) 61.82±9.871)SE后48 h PILO組 19.66±1.861) 160.65±17.461) 52.89±7.651) 57.68±9.111)DZ組 15.34±2.682) 175.31±13.552) 62.16±11.232) 24.83±3.362)DZ+5-HD組 18.46±2.141) 162.86±16.571) 53.62±9.451) 59.31±8.541)

3 討論

8-OHdG是DNA氧化損傷的產物，是目前最常用的 DNA氧化損傷的檢測指標之一。MDA是脂質過氧化反應的產物，其含量可反映脂質過氧化反應的程度，并間接反映引起脂質過氧化反應的自由基的水平。癲癇發作時通過脂質過氧化與氧化應激損傷可損傷線粒體的功能與結構，影響呼吸鏈，進一步增加ROS的生成，從而形成惡性循環，最終可導致細胞壞死或者凋亡〔5〕。

本研究結果表明大鼠SE后海馬神經元存在氧化應激損傷，并可能成為治療靶點。在缺血再灌注動物模型中mitoKATP開放劑DZ、吡那地爾等均可模擬缺血預處理的保護作用，mitoKATP阻斷劑5-HD可阻斷這種保護作用。關于mitoKATP開放劑對神經元保護作用的機制目前尚未完全明確，Teshima等〔3〕學者研究認為，mitoKATP通過維持線粒體膜電位而抑制神經元凋亡從而起到神經保護作用。Sun等〔4〕研究腎臟的缺血再灌注模型后提出，mitoKATP可通過抑制線粒體生成過多的ROS從而抑制細胞凋亡，起到保護臟器功能的作用。Roseborough等〔6〕研究兔脊髓缺血模型認為，mitoKATP開放劑DZ通過降低內源性ROS的產生，保護線粒體結構的完整性，改善缺血脊髓的功能。還有的學者〔7〕認為，mitoKATP開放劑通過防止線粒體腫脹，限制Ca2+的內流，抑制細胞色素C的釋放而起到神經保護作用。

盡管如此，DZ是否對癲癇發作以及癲癇發作導致的腦損傷具有保護作用及其可能作用機制還知之甚少。本研究結果表明mitoKATP開放劑DZ能減輕大鼠SE后海馬神經元的氧化應激損傷，對SE后海馬神經元有保護作用。我們用5-HD后可拮抗DZ的神經保護作用，進一步證明了DZ是通過開放mitoKATP起神經保護作用的。本研究結果提示開放mitoKATP可能為癲癇的神經保護提供新的前景。

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