葛根異黃酮對衰老模型大鼠學習記憶及海馬CA1區長時程增強的影響

王愛梅 徐持華 (河南南陽醫學高等專科學校，河南 南陽 473061)

近年來，國內外對葛根提取物——葛根異黃酮的藥理作用進行了較多的研究，發現其具有治療心血管疾病、抗癌作用，治療骨質疏松、預防和治療糖尿病等作用〔1～4〕。葛根異黃酮對衰老模型大鼠學習記憶及海馬CA1區長時程增強(LTP)的影響少見報道，本實驗欲探討葛根異黃酮改善衰老模型大鼠學習記憶能力及對海馬神經突觸可塑性的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用健康雌性Wistar大鼠55只，3～4月齡，體重(180±20)g，由河南醫學動物實驗中心提供(許可證號:410117)。

1.2 實驗藥物試劑及儀器 D-半乳糖由上海試劑二廠提供，批號20050422，葛根異黃酮由南陽張仲景現代中藥發展有限責任公司提供，批號20080722，20%烏拉坦由上海國藥集團化學試劑有限公司提供，批號T20080319，大鼠跳臺系中國醫學科學院藥物研究所研制，RM6240型生物信號采集系統由成都儀器廠研制。

1.3 動物分組及給藥 Wistar大鼠隨機分為生理鹽水組，衰老模型組，藥物低、中、高劑量組，每組11只。造模時，模型組、藥物組每天頸背部皮下注射1%D-半乳糖100 mg/kg，生理鹽水組每天頸背部皮下注射等量生理鹽水，連續6 w。造模成功后，第2天開始灌胃給藥，藥物低、中、高劑量組每天分別給予40、80、160 mg/kg葛根異黃酮灌胃，模型組、生理鹽水組每天給予80 mg/kg生理鹽水灌胃，連續8 w。

1.4 大鼠學習記憶能力測定——Morris水迷宮實驗 動物灌胃結束后，進行Morris水迷宮實驗。其中定位航行實驗用于測量大鼠對水迷宮學習和記憶的獲取能力，記錄逃避潛伏期(EL);空間探索實驗用于測量大鼠學會尋找平臺后，對平臺空間位置記憶的保持能力，記錄120 s內大鼠在平臺象限的游泳距離占總距離的百分比。

1.5 電生理學檢測

1.5.1 大鼠的固定和電極的定位 在行為學結束后，大鼠以20%烏拉坦(1.5 g/kg)腹腔麻醉后，用耳桿將大鼠頭部水平固定于立體定位儀上，參照Paxinos和Watson《大鼠腦立體定位圖譜》確定記錄電極和刺激電極的準確位置，在立體定位儀的引導下緩慢將電極穿過大鼠皮層至海馬，調整記錄電極及刺激電極在海馬植入的最佳深度，至記錄到最大的群體峰電位(PS)為止。以上操作均在屏蔽籠內完成。實驗結束后，對記錄電極、刺激電極作定位檢查，定位不準確者剔除。

1.5.2 PS記錄和LTP誘導 海馬CA1區LTP的誘導方法參照文獻，首先記錄單個刺激誘發的PS 30 min作為基值，然后給予波寬0.1 ms、頻率100 Hz的矩形波進行高頻刺激(HFS)誘發LTP，記錄HFS后60 min內的 PS。

1.5.3 觀測指標和測量方法 實驗中以PS幅度相對值(%)為觀測指標，并觀察其增幅情況。具體測量方法是，以HFS前30 min的PS值的均數為基線值，即100%，實驗中每個PS值與之相比即得各點的PS幅度相對值，PS平均幅值高于基線值至少20%以上并持續30 min以上者可視為產生了LTP，連續觀察記錄60 min。PS幅值和潛伏期計算方法參照文獻〔7〕。

1.6 統計學方法 使用SPSS13.0軟件包進行數據分析，數據用±s表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用方差分析。

2 結果

2.1 各組大鼠學習記憶能力比較 隨著訓練的進行，各實驗組EL均不斷縮短，與模型組相比，中、高劑量組EL明顯縮短(P＜0.01);各實驗組撤離平臺后大鼠在原平臺象限內游泳的距離占整個游泳距離的百分比顯示:與模型組相比，中、高劑量組所占距離百分比明顯增高(P＜0.01，P＜0.05)，這說明葛根異黃酮中、高劑量對大鼠空間方位記憶能力有一定的影響。而低劑量組雖然要高些，但差異無顯著性(P＞0.05)，見表1。

2.2 電生理學檢測結果 高頻刺激后各組大鼠PS幅度較刺激前增加，表明各組大鼠海馬都有LTP的形成，如表5，高頻刺激后模型組PS幅度有一定程度的增強，但明顯低于生理鹽水組(P＜0.01);中、高劑量組高頻刺激后PS幅度明顯大于模型組(P＜0.01);低劑量組與模型組差異不明顯(P＞0.05)。從高頻刺激后PS幅度變化可看出，生理鹽水組、中、高劑量組在所記錄的60 min內變化不明顯，模型組和低劑量組的PS幅度卻隨著時間逐漸衰減。模型組和低劑量組在60 min內PS幅度均低于生理鹽水組、中、高劑量組(P＜0.01)。生理鹽水組、中、高劑量組在所記錄的60 min內變化不明顯無顯著性差異。

表1 各組大鼠學習記憶能力及高頻刺激后PS增幅比較(±s)

表1 各組大鼠學習記憶能力及高頻刺激后PS增幅比較(±s)

與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 n EL(s) 所占距離百分比(%)PS增幅(%)生理鹽水組 9 20.78±3.122) 44.54±2.292) 170.20±0.562)模型組 9 42.24±5.41 33.94±1.69 124.57±1.06低劑量組 9 25.50±3.661) 38.55±3.70 126.44±0.87中劑量組 10 23.80±1.492) 41.61±2.561) 163.49±0.762)高劑量組 10 21.82±2.742) 43.65±1.562) 166.92±0.742)

3 討論

學習記憶的神經生物學基礎是神經細胞之間的聯系結構突觸的可塑性變化，大腦邊緣系統海馬結構作為學習記憶的關鍵部位，是一個具有可塑性的腦區。LTP被認為是研究學習和記憶的神經元可塑性的最好的模型〔8〕。LTP一般是指在條件刺激(多為較高頻率的強直刺激)后，相同的測試刺激所引起的誘發突觸反應長時問(一般長于半小時)明顯增大的現象。LTP的形成是突觸前后機制共同作用的結果，與突觸前神經遞質釋放、突觸后相關受體的Ca2+通道、蛋白激酶、逆行信使、即早基因等關系密切。在大鼠海馬，來自CA3區錐體細胞的Schaffer側支與CA1區錐體細胞樹突形成突觸，刺激Schaffer側支使CA1區錐體細胞任何樹突層受刺激均可誘出LTP。常用群峰電位(PS)振幅增大或PS潛伏期減小來判定突觸傳遞是否強化以及是否出現LTP。LTP反映了突觸可塑性變化中的神經電生理活動方面的改變，并作為神經科學研究當中衡量突觸可塑性的一個主要的電生理指標。本文中，造模后PS振幅減小而用藥后，PS振幅增大說明葛根異黃酮對于突觸的可塑性具有一定的促進作用，并有可能是其改善學習記憶功能又一重要機制。

1 郭建平，宮明利，陳啟蒙，等.葛根黃酮滴丸對離體豚鼠心臟冠脈血流量的影響〔J〕.藥物研究，2008;17(5):5-6.

2 徐 芾，金邦荃，武衛平，等.植物異黃酮對更年期婦女骨密度和骨代謝血清生化指標的影響〔J〕.中國婦幼保健，2007;22:1517-9.

3 王慶端，江金花，孫文欣，等.葛根總黃酮對鼠肝微粒體中細胞色素P450含量的影響〔J〕.中國藥理學通報，2000;16(3):354-5.

4 曾 明，張漢明，鄭水慶，等.葛根提取物對糖尿病大鼠血糖和血流動力學的影響〔J〕.解放軍藥學學報，2004;20(4):293-4.

5 Freir DB，Costello DA，Herron CE.Aβ25-35-induced depression of longterm potentiation in area CAI in vivo and in vitro is attenuated by verapamil〔J〕.J Neurophysiol，2003;89(6):3061-9.

6 Yang Y，Zheng X，Wang Y，et al.Stress enables synaptic depression in CA1 synapses by acute and chronic morphine:possible mechanisms for corticosterone on opiate addiction〔J〕.J Neurosci，2004;24:2412-20.

7 Ikngaya Y，Saim H，Abe K.Attenuated hippocampal long-term potentiation in basolateral amygdala-lesioned rats〔J〕.Brain Res，1994;656:157.

8 Gruart A，Munoz MD，Delgado-Garcia JM.Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice〔J〕.Neuroscience，2006;26(4):1077-87.