黃芪聯(lián)合胰島素療法對(duì)糖尿病大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激的影響

李 陽(yáng) 孫中華 奚樹剛 高 影 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

2004年美國(guó)糖尿病(DM)協(xié)會(huì)年會(huì)提出了DM及其慢性并發(fā)癥的共同發(fā)病機(jī)制，即高糖損傷的共同基礎(chǔ)-氧化應(yīng)激〔1〕。DM狀態(tài)下，一些病理因素通過促進(jìn)機(jī)體內(nèi)活性氧簇(ROS)生成，使機(jī)體抗氧化物如超氧化物歧化酶(SOD)活性降低，組織中氧自由基及氧化產(chǎn)物如丙二醛(MDA)含量升高，引起組織損傷，進(jìn)一步加重DM及其慢性并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。單純胰島素治療，并不能根本解決DM的氧化應(yīng)激狀態(tài)。黃芪作為一種抗氧化劑，在臨床治療DM中已有應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)通過黃芪聯(lián)合胰島素治療DM大鼠，觀察其對(duì)大鼠血糖、體重以及氧化應(yīng)激的影響，為黃芪聯(lián)合胰島素療法治療DM提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及主要儀器 健康成年 Wistar雄性大鼠，6周齡，體重(200±10)g，購(gòu)于北京華阜康生物科技有限公司。鏈脲酶菌素(STZ)。黃芪注射液(黑龍江珍寶島制藥公司)，購(gòu)于吉大三院。魚精蛋白鋅胰島素購(gòu)于江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司(批號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H10890001)，置于冰箱中4℃保存。大鼠實(shí)驗(yàn)過程均在吉林大學(xué)衛(wèi)生監(jiān)測(cè)中心實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。大鼠SOD、MDA試劑盒購(gòu)南京建成生物公司。血糖儀(FreeStyle)由美國(guó)雅培生物科技有限公司提供。

1.2 動(dòng)物模型制作與分組 健康成年Wistar雌性大鼠30只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，禁食12 h稱重。STZ溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，給藥劑量為60 mg/kg，溶劑為0.1 mol/L，pH=4.5枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液。再選取10只大鼠給予等劑量的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液腹腔注射，隨機(jī)取5只作為對(duì)照組。2 d后尾靜脈采血測(cè)血糖值，血糖≥16.7 mmol/L作為大鼠建模成功的標(biāo)準(zhǔn)。血糖值＜16.7 mmol/L的大鼠隔日二次造模，STZ給藥劑量為40 mg/kg。連續(xù) 1、3、5 d 測(cè)大鼠血糖，血糖值均 ≥16.7 mmol/L，大鼠造模成功。造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、黃芪組、胰島素組和黃芪+胰島素組，每組5只。

1.3 給藥方法 造模成功后，黃芪組、黃芪+胰島素組給予黃芪注射液5 ml/kg(相當(dāng)于原材料10 g/kg)灌胃，每日1次，模型組及胰島素組給予等量的生理鹽水灌胃。胰島素組及黃芪+胰島素組初始給予2 U胰島素，大腿外側(cè)皮下注射，每3 d測(cè)一次血糖，根據(jù)血糖情況調(diào)整胰島素劑量，將血糖值控制在4～8 mmol/L之間。

1.4 標(biāo)本采集及血體重、血糖、MDA、SOD測(cè)定 給藥8 w后，稱重、尾靜脈采血測(cè)血糖，10%水合氯醛麻醉后腹主動(dòng)脈取血，常溫靜置30 min，3 000 r/min，10 min分離血清，置于 －80℃冰箱中保存待用。體重每3 d測(cè)一次，血糖每3 d應(yīng)用自動(dòng)血糖儀測(cè)定一次，測(cè)定尾靜脈采血的第二滴血。MDA含量測(cè)定采用TBARS法，SOD活性測(cè)定采用DTNB法。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)8 w后各組大鼠SOD及MDA水平 DM模型組及其治療組SOD活性明顯低于正常對(duì)照組，MDA水平明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05);黃芪治療組、胰島素治療組和黃芪+胰島素治療組SOD活性明顯高于DM模型組，MDA水平明顯低于DM模型組(P＜0.05)，黃芪治療組和胰島素治療組SOD活性明顯低于黃芪+胰島素治療組，MDA水平明顯低于黃芪+胰島素治療組(P＜0.05)。見表1。

2.2 實(shí)驗(yàn)8 w后各組大鼠血糖水平 DM模型組和黃芪治療組血糖水平明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，黃芪治療組、胰島素治療組和黃芪+胰島素治療組血糖水平明顯低于DM模型組(P＜0.05)，黃芪治療組和胰島素治療組血糖水平明顯高于黃芪+胰島素治療組(P＜0.05)。見表2。

2.3 實(shí)驗(yàn)8 w后各組大鼠體重變化情況 DM模型組及其治療組體重明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.05)，黃芪治療組、胰島素治療組和黃芪+胰島素治療組體重明顯高于DM模型組(P＜0.05)，黃芪治療組和胰島素治療組體重明顯低于黃芪+胰島素治療組(P＜0.05)。見表2。

表1 各組大鼠血清SOD活性和MDA含量比較(±s，n=5)

表1 各組大鼠血清SOD活性和MDA含量比較(±s，n=5)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.05;與DM模型組比較:2)P＜0.05;與黃芪組和胰島素組比較:3)P＜0.05，下表同

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表2 各組大鼠血糖水平和體重比較(±s，n=5)

表2 各組大鼠血糖水平和體重比較(±s，n=5)

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3 討論

世界范圍內(nèi)的糖尿病患病率預(yù)計(jì)將從2000年的2.8%(約1.7億患者)增加到2030年的4.4%(約3.6億患者)〔2〕。中國(guó)流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國(guó)20歲以上人群中，總體DM患病率達(dá)9.7%〔3〕。目前DM的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但現(xiàn)有研究已表明，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致胰島β細(xì)胞葡萄糖毒性發(fā)生發(fā)展中的一個(gè)十分重要的機(jī)制〔4，5〕。目前已有大量關(guān)于黃芪治療DM及其慢性并發(fā)癥的研究，均表明黃芪對(duì)DM病情有所改善〔6，7〕。與本實(shí)驗(yàn)中黃芪組治療結(jié)果一致。然而其治療效果并不十分理想。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體內(nèi)ROS和活性氮簇(RNS)產(chǎn)生過多，超出機(jī)體對(duì)其的清除能力，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷。DM時(shí)一些病理因素導(dǎo)致自由基產(chǎn)生增加，過多的自由基消耗了內(nèi)源性抗氧化劑如SOD等，機(jī)體抗氧化能力下降，導(dǎo)致氧化與抗氧化這一動(dòng)態(tài)平衡被破壞，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損，并同時(shí)形成MDA。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，可間接反映機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激的程度。SOD是一種糖蛋白，屬于內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)，是抗氧化的主要指標(biāo)之一，可清除氧自由基及其分解產(chǎn)物，SOD活力的高低間接反映了機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生及其對(duì)組織細(xì)胞的損傷情況，亦反映了機(jī)體對(duì)氧自由基的清除能力。大量研究發(fā)現(xiàn)，DM時(shí)，機(jī)體存在明顯氧化應(yīng)激，抗氧化酶活性下降和ROS增加與其發(fā)病及并發(fā)癥發(fā)生有著密切關(guān)系〔8〕。亦有研究表明，高血糖狀態(tài)是引起DM發(fā)病及其并發(fā)癥的主要原因。高血糖狀態(tài)可在體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，并使體內(nèi)自由基防御機(jī)制受損，兩者共同導(dǎo)致氧化應(yīng)激加重〔9〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DM大鼠體內(nèi)MDA水平顯著增高，SOD活性顯著下降，提示大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化顯著增強(qiáng)，與文獻(xiàn)〔10〕報(bào)道一致。因此，對(duì)DM患者應(yīng)進(jìn)行抗氧化治療。

黃芪注射液是傳統(tǒng)中藥黃芪提取物的滅菌水溶液，目前觀點(diǎn)認(rèn)為，黃芪具有抗脂質(zhì)過氧化的作用〔11〕，可以與體內(nèi)SOD結(jié)合，提高其活性。體外實(shí)驗(yàn)顯示黃芪3種提取成分有良好的清除氧自由基的作用〔12〕。本實(shí)驗(yàn)表明黃芪及胰島素均可一定程度上降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平。提示胰島素聯(lián)合黃芪治療組在治療DM、改善高糖及機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的效果方面，均優(yōu)于單純應(yīng)用胰島素或黃芪組，具有重要的臨床意義。

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