心理應(yīng)激對大鼠氧化應(yīng)激的影響及TLR4的作用

趙詠梅，王希柱，劉寶義

(1.開灤集團有限責任公司林西醫(yī)院，河北 唐山 063103；2.河北聯(lián)合大學附屬唐山人民醫(yī)院，河北 唐山 063000)

研究表明，心理應(yīng)激時經(jīng)神經(jīng)內(nèi)分泌機制釋放的應(yīng)激激素能夠啟動或參與和炎癥反應(yīng)相似的調(diào)節(jié)機制，促進細胞因子的釋放，引起血管壁的慢性炎癥反應(yīng)，即心理性刺激觸發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)實際上涵蓋了炎癥反應(yīng)[1-2]，但其機制尚不明確。Toll樣受體(TLRs)是一種介導炎癥和天然免疫的跨膜信號轉(zhuǎn)導受體家族，其中TLR4與動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生發(fā)展及斑塊穩(wěn)定性關(guān)系密切[3]。本研究擬通過慢性空瓶刺激建立大鼠心理應(yīng)激模型，觀察各組大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)和主動脈TLR4表達并進行定量分析，初步探討心理應(yīng)激對大鼠氧化應(yīng)激的影響及TLR4所起的作用。

1 材料與方法

1.1 材料及設(shè)備 兔抗大鼠TLR4多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔SP-9001免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TNF-α放免試劑盒購自解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所；高速冷凍離心機(法國Jouan公司)、0725型紫外光柵分光光度儀(山東高密分析儀器廠)、光學顯微鏡(Olympus，日本)，HH-4型數(shù)顯恒溫水浴箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠)、DHG(102)型電熱干燥箱(山東濰坊醫(yī)療器械廠)、RM213轉(zhuǎn)輪石蠟切片機(德國Leica公司)。

1.2 實驗動物與飼養(yǎng)條件 健康雄性Wistar大鼠40只，體重180～200 g。由華北煤炭醫(yī)學院實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)環(huán)境下，室溫18℃～21℃、相對濕度45%～55%。

1.3 動物分組與處理 將40只大鼠隨機分為正常對照組(NC)、無應(yīng)激組(NS)、生理應(yīng)激組(PS)和心理應(yīng)激組(ES)，每組各10只。ES組和PS組分別在不同的房間單籠喂養(yǎng)，NC組和NS組每籠5只。NS組、PS組和ES組給予高脂飲食+維生素D3負荷(一次性腹腔注射維生素D360萬IU/kg)，NC組給予普通飲食+生理鹽水(一次性腹腔注射等體積生理鹽水)。高脂飲食配方：3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%普通飼料。

1.4 應(yīng)激模型的建立 參照邵楓等[4]的方法制作心理應(yīng)激模型。所有動物經(jīng)一周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，定時喂水訓練8周：每天僅在8:00～8:10和20:00～20:10給予定時飲水兩次，每次10 min，其余時間不予飲水。于第8周最后一次定時飲水期間開始給予心理應(yīng)激和生理應(yīng)激。具體方法是ES組大鼠在原定時喂水期間不喂水并給予無規(guī)律的空瓶刺激，每天0～2次不等，使之產(chǎn)生慢性情緒應(yīng)激。PS組大鼠在此期間亦不喂水，但也不給予空瓶刺激，目的是對比觀察生理性缺水對實驗的影響。應(yīng)激在連續(xù)的兩周內(nèi)被給予14次，每次10 min。NS組和NC組大鼠繼續(xù)2次/d定時飲水。整個實驗周期為10周。

1.5 標本采集與觀察指標 于末次應(yīng)激結(jié)束后立即用10%水合氯醛(30 mg/kg)行腹腔麻醉，腹主動脈取血、靜置、離心(3 000 rpm)、收集血清分裝，置于-20℃冰箱保存待檢。取血后取主動脈根部至主動脈弓處血管0.5 cm，4℃生理鹽水沖洗、4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、連續(xù)切片，用于HE染色及免疫組化測定TLR4表達(SP法)。黃嘌呤氧化酶法檢測過氧化物歧化酶(SOD)，硫代巴比妥酸(TBA)法檢測丙二醛(MDA)，放射免疫法測定血清腫瘤壞死因子(TNF-α)水平，操作程序嚴格按照試劑盒說明書進行。利用光鏡(400倍)觀察TLR4表達和分布情況，以血管內(nèi)膜出現(xiàn)棕黃色者為陽性表達。每張切片隨機選取4個視野，采用Micro-Optic數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)分析陽性細胞單位面積平均光密度值(OD)，取平均值進行統(tǒng)計分析。

1.6 統(tǒng)計學方法 SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組間計量資料的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩組間比較方差齊時采用LSD檢驗，方差不齊時采用Dunnett's T3檢驗。

2 結(jié)果

2.1 氧化應(yīng)激 ES組大鼠血清SOD活力明顯低于其他三組而MDA含量明顯升高；NS組、PS組血清SOD活力低于NC組而MDA含量升高；PS組與NS組比較，血清SOD活力亦降低、MDA含量升高，見表1。

表1 各組大鼠血清SOD、MDA比較（±s）

表1 各組大鼠血清SOD、MDA比較（±s）

注：同NC組比較，●P<0.05；同NS組比較，★P<0.05；同PS組比較，▲P<0.05。

組別MDA(nmol/ml)SOD(U/ml)NC NS PS ES 5.58±0.22 6.31±0.18●6.56±0.22●★7.58±0.34●★▲222.31±13.61 200.71±12.91●187.22±10.28●★170.57±11.28●★▲

2.2 炎性相關(guān)因子 NC組、NS組、PS組和ES組的大鼠血清TNF-α分別為(1.772±0.0751)μg/L、(2.181±0.0847)μg/L、(2.189±0.0989)μg/L和(2.447±0.083)μg/L。ES組大鼠血清TNF-α水平明顯高于其他三組；NS組、PS組亦高于NC組；PS組與NS組比較差異無統(tǒng)計學意義。

2.3 主動脈HE染色 光鏡顯示ES組大鼠主動脈出現(xiàn)早期AS改變：血管內(nèi)膜連續(xù)性中斷，內(nèi)皮細胞不規(guī)則脫落，內(nèi)彈力板薄厚不均勻，部分交織狀排列或呈波浪狀，并出現(xiàn)斷裂分離現(xiàn)象，平滑肌細胞增生且與中層彈力板之間排列紊亂。其余三組未見明顯形態(tài)學改變。

2.4 主動脈TLR4表達 免疫組化結(jié)果顯示TLR4在NC組幾乎無陽性表達，NS組、PS組、ES組均有表達，OD值分別為(0.037±0.005)、(0.238±0.015)、(0.250±0.012)和(0.334±0.010)，蘇木素復染顯示其主要表達于血管內(nèi)膜。ES組表達強度明顯高于PS組和NS組；PS組與NS組表達強度比較差異無統(tǒng)計學意義。

3 討 論

本實驗所采用的慢性空瓶刺激是一種與憤怒或焦慮關(guān)系更為密切的慢性心理應(yīng)激模型[4]。實驗結(jié)果顯示，ES組、PS組、NS組均出現(xiàn)了明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)(血清SOD活力下降而MDA含量上升)和炎癥反應(yīng)(血清TNF-α升高)。而ES組較其他兩個處理組引起的導致血管內(nèi)皮細胞損傷相關(guān)因素變化更為明顯：氧化應(yīng)激損傷(血清SOD活力下降而MDA含量升高)、炎癥反應(yīng)(血清TNF-α升高)。PS組較NS組氧化應(yīng)激損傷更為明顯(血清SOD活力下降而MDA含量上升)，但兩組間炎癥反應(yīng)(血清TNF-α)差異無統(tǒng)計學意義。主動脈HE染色顯示，ES組出現(xiàn)了早期AS改變，但并無動脈硬化斑塊等典型AS病理變化。

研究表明，氧化應(yīng)激在AS發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。過多的活性氧不僅直接損傷血管內(nèi)皮細胞，還通過信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)引起炎癥反應(yīng)效應(yīng)物的相關(guān)基因核轉(zhuǎn)錄，增強血管局部炎癥反應(yīng)。MDA反映體內(nèi)活性氧水平，間接地體現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷的嚴重程度。SOD是一種抗氧化酶，發(fā)揮保護細胞免受氧化應(yīng)激損傷的作用。本實驗結(jié)果顯示，心理應(yīng)激可導致明顯的氧化應(yīng)激損傷，與既往研究結(jié)果一致[6-7]。NS組、PS組大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)亦較NC組明顯，提示不僅是心理應(yīng)激，生理應(yīng)激和高脂飲食也能影響動物體內(nèi)氧化和抗氧化過程的平衡，多種因素聯(lián)合作用可加重機體的氧化應(yīng)激損傷，進而促進AS的發(fā)生和發(fā)展。

Ross[8]指出，AS是一種慢性炎癥性疾病。各種危險因素損傷血管內(nèi)皮細胞，使之表達各種趨化因子和粘附分子，介導單核-巨噬細胞和淋巴細胞粘附、聚集于內(nèi)膜損傷位點表面并移行增殖于內(nèi)膜下。激活的內(nèi)皮細胞與巨噬細胞釋放TNF-α、白細胞介素(IL)-1等多種炎性細胞因子，擴大炎癥反應(yīng)的級聯(lián)效應(yīng)。ES組、PS組、NS組血清TNF-α均較NC組升高，特別是ES組升高明顯，提示心理應(yīng)激，生理應(yīng)激和高脂飲食均能引起大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，而心理應(yīng)激的影響更為嚴重。

TLR4突出的生物學活性是促進機體內(nèi)炎性細胞因子的合成和釋放，引發(fā)機體的炎癥反應(yīng)[9]。其不僅在AS斑塊組織中表達強烈，慢性炎癥過程亦可上調(diào)大血管組織中TLR4表達[10]。我們的實驗結(jié)果顯示，在出現(xiàn)早期AS病理改變的ES組大鼠以及沒有出現(xiàn)明顯組織學改變、但伴有氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)的PS、NS組大鼠，主動脈TLR4表達均上調(diào)，提示TLR4參與了大血管早期炎性改變的發(fā)生。

Caso等[11]報道，TLR4可介導亞急性應(yīng)激后腦組織的炎性反應(yīng)。另有研究表明[12]，慢性應(yīng)激可通過TLR4-NF-κB途徑引起TNF-α等炎性因子的釋放，導致心肌細胞損傷。我們通過對四組大鼠主動脈TLR4的表達強度進行統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，ES組大鼠主動脈TLR4表達明顯增強，結(jié)合我們前面的討論，心理應(yīng)激可導致與AS密切相關(guān)的氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)，提示TLR4可能部分介導了心理應(yīng)激導致的AS發(fā)病過程。它可能在體內(nèi)環(huán)境中的某些變化(如氧化應(yīng)激導致體內(nèi)慢性炎癥反應(yīng))和動脈形態(tài)學變化之間起橋梁作用。雖然心理應(yīng)激引起AS炎癥反應(yīng)可能存在多方面機制，但ES組主動脈TLR4表達上調(diào)也提示，心理應(yīng)激可能至少部分是通過TLR4的激活導致血管局部的炎癥反應(yīng)，而血管局部炎癥活動是AS形成過程中最主要的特征，動脈組織中出現(xiàn)炎癥因子表達增高可視為AS形成的一個早期信號。PS組主動脈TLR4表達較NS組無明顯差異，考慮可能與生理應(yīng)激的強度或?qū)嶒瀯游飻?shù)量偏少有關(guān)。

TLR4是細菌脂多糖的關(guān)鍵受體。Kieran等[13]研究發(fā)現(xiàn)，TLR4介導了脂多糖誘導的單核細胞活性氧的產(chǎn)生，而抗氧化劑能夠抑制脂多糖所誘導的細胞因子基因靶點活化，氧化應(yīng)激可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子調(diào)節(jié)TLR4的表達，提示氧化應(yīng)激能夠影響TLR4介導的炎癥反應(yīng)。也有研究認為低氧可通過內(nèi)皮細胞線粒體產(chǎn)生活性氧增多而下調(diào)TLR4表達[14]。本實驗顯示，心理應(yīng)激在導致機體氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)的同時，主動脈出現(xiàn)早期AS病理變化且TLR4表達增強，提示氧化應(yīng)激有可能在AS形成的早期，通過激活TLR4釋放TNF-α等炎性因子促進血管壁的炎癥反應(yīng)，進而促進AS形成。

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