齦下菌斑涂片兩種染色分類方法的比較

王 冬

（山西省運城市中心醫院，山西 運城 044000）

牙周病一種由微生物引起的感染性疾病，病原微生物可能包括真菌、病毒和細菌等，牙菌斑中的細菌研究作為口腔醫學領域的熱點，一直在尋找合理的染色法來對細菌值進行計數，使人們在臨床應用中掌握更多治療牙周炎的醫學方法。在之前的微生物學研究中常用的細菌染色法有革蘭染色，芽孢染色、抗酸染色法等，這些方法操作復雜不易掌握。現臨床上現有采用剛果紅負染法，作為一種微生物檢測方法，口腔微生物的細菌學檢查的應用中，可有效的檢測牙周病治療過程中，戴正畸矯正器或修復體時口腔細菌分布變化[1]，判斷藥效以及治療方法的臨床療效。很多文獻資料表明，剛果紅負染法可以有效的計算出螺旋體菌數值。但在齦下菌斑樣本中有多種菌類，本院就對齦下菌斑涂片采用了傳統的細菌染色法即革蘭染色與剛果紅負法染對同一樣本進行不同染色，旨在研究剛果紅負染在細菌總數一定的情況下，對細菌的統計，探討其他細菌計數的偏差是否會影響到螺旋體的比例，進一步比較兩種方法的優缺點，以便在以后的臨床上可以選擇合理的染色方法，現將研究報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2010年5月至2011年6月，在我院口腔門診收治的牙周病患者36例，男性14例，女性24例，年齡21～79歲，平均37.5歲，取每位患者不同牙的2個位點，牙周袋深在3.2～7.6mm之間，所有患者無其他口腔內并發癥。

1.2 方法

①取樣：確定取樣的病牙位點，先去除表面的齦上菌斑和牙石，再用一次性探針插入牙周袋底，要沿病牙的牙冠或根面刮取齦下菌斑。將所采集到的菌斑，先置于滴有生理鹽水的載玻片上，要進行剛果紅負染的標本在涂勻后再放入滴有2%剛果紅的載玻片上，將染料均勻涂開，約0.1ml2%剛果紅染液涂成直徑約1.5～2cm薄厚最為適宜，置空氣中自然風干，每個位點要做成至少2張涂片，一張先進行剛果紅染液染色后備用，一張只涂有生理鹽水備用。②染色：采用剛果紅負染法，先在一廣口瓶中裝入12mol/L的濃硫酸，再將已干燥涂有剛果紅的一面蓋于廣口瓶上，待涂片顏色由紅色變成藍色后，取下待觀察。本實驗中采用改良后革蘭氏染色法，先把生理鹽水涂片過火固定，再用結晶紫染液染色1min，水沖洗，然后用革蘭氏碘液染色1min，水沖洗，接著再用0.4%復紅乙醇液染色30s，水沖洗，最后用吸水紙吸干后待鏡檢[2]。③計數：先在所有涂片上加上鏡油，在把涂片置于顯微鏡油鏡下（15×100）觀察，選擇細菌分布均勻視野進行分類計數。觀察計數5中不同形態的細菌200個，其中螺旋體、球菌、桿菌、彎曲菌、梭狀菌。

1.3 統計方法

采用統計軟件SPSS10.01進行數據處理，每種菌類采用t值檢驗，P＜0.05表示有統計學意義。

2 結 果

齦下菌斑生理鹽水涂片經過剛果紅負染，再由濃鹽酸蒸氣熏蒸后，涂片的背景呈現藍色，由于細菌未被著色，在藍色背景下就呈白色。齦下菌斑生理鹽水涂片經革蘭染色后，在光學顯微鏡油鏡下觀察見紅色菌為革蘭陰性菌， 藍色菌為革蘭陽性菌。分別在光學顯微鏡下計數5種形狀的細菌。見表1。

表1 兩種染色分類方法的比較

結果顯示，兩種染色方法所觀察到的螺旋體、彎曲菌、梭狀菌3 種形態的菌數值P＞0.05，不存在顯著性差異，不具有統計學意義，球菌、桿菌兩種形態菌數值P＜0.01，存在顯著性差異，具有高度統計學意義。

3 討 論

細菌作為一種無色半透明的微小生物，怎樣才能清晰觀察到其形態結構一直是微生物研究中重要環節，現實驗中多使用顯微鏡和細菌的染色相結合來清楚地觀察細菌的形態結構，故在實驗過程中，染色的好壞直接決定能否清楚地觀察細菌的結構和形態[3]。傳統細菌的染色方法主要革蘭染色，芽孢染色、抗酸染色等。本文實驗中采取的革蘭染色在傳統的染色方法基礎之上加以改進，同樣取得了正確無誤的染色結果，顏色突出易識別。在過去的革蘭染色法中，一直運用蘭氏4步法，雖效果好，但操作過程復雜不易掌握，不適宜初學中使用，三步法原理與四步法相同， 只是把酒精脫色和復染合并成用0.4%復紅乙醇液染色一步中進行，因為用酒精脫色，過度脫色會把革蘭氏陽性菌染成紅色，脫色不夠會把革蘭氏陰性菌染成陽性菌，現采用是三步法不僅避免了這樣的問題，還節約了操作時間。

剛果紅作為一種酸性染料，在蒸餾水中以游離形態存在，但一遇到強酸，就會發生沉淀，剛果紅染料在pH＜3.0時為藍色，pH＞5.0時為紅色，在一般環境中空氣pH＞5.0，故涂片在放置時呈現紅色。在放與顯微鏡觀察前，經過濃鹽酸蒸汽熏蒸，剛果紅由紅色變為藍色，但細菌不著色，呈現白色，故在藍色的背景下可以清晰觀察到白色細菌的形態。實驗結果可以看到，對于形狀較特殊，菌體較大的螺旋體、彎曲菌、梭狀菌兩種染色法計數無差異，從本實驗得到是數據亦可證明，剛果紅負染法因其操作簡單，是檢測螺旋體的良好方法。在觀察過程中，在剛果紅負染鏡檢樣本中可以看到較多形態、大小似細菌的顆粒，這些顆粒的大小與油鏡下觀察的球菌相似，這可能是造成結果中球菌、桿菌兩種染色方法差異的原因之一。而采用的革蘭染色法，因細菌與革蘭染液有特殊的結合，故非細菌顆粒與球菌在著色上存在差異，可以將兩者區分開。

革蘭染色方法雖步驟多，操作復雜，技術要求高，但能很好的分出但對革蘭陽性、陰性菌，在臨床上分離致病菌有實際意義，剛果紅負染法作為操作方便的檢測法，其檢測螺旋體可同樣可用于監測治療效果[4]，故在實際應用中，可根據目的選擇適宜的染色方法。

[1]寇育榮,潘亞萍,張光和.牙周炎治療過程中齦下菌斑的動態觀察[J].中國微生態學雜志, 1999,11(5): 301.

[2]肖曉蓉.口腔微生物學及實驗技術[M]北京:北京醫科大學,中國協和醫科大學聯合出版社,1993:85.

[3]白毓謙,方善康,高東,等.微生物實驗技術[M].濟南:山東大學出版社,1986:50-52.

[4]李德懿.牙周病微生物學[M].天津:科技翻譯出版公司,1994:77.